姜黄素调节NMDAR/Ca2/CaMKⅡ信号通路对异氟醚诱导的幼龄小鼠术后认知功能障碍的影响.pdf
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1、目的探讨姜黄素(Cur)调节N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)/钙离子(Ca2+)/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)信号通路对异氟醚(ISO)诱导的幼龄小鼠术后认知功能障碍(POCD)的影响。方法将72只C57BL/6J小鼠分为对照组、ISO组、低剂量Cur组(Cur-L组,50 mg/kg)、中剂量Cur组(Cur-M组,100 mg/kg)、高剂量Cur组(Cur-H组,200 mg/kg)、Cur-H+NMDA(NMDAR激活剂)组(200 mg/kg+8 mg/kg),每组12只。经对应给药处理30 min后,对照组小鼠吸入含30%氧气和空气的混合气体2 h,其余各组小鼠吸入2%
2、ISO 2 h,每天1次,持续14 d。末次给药24 h后,Morris水迷宫实验检测小鼠学习与空间记忆能力;HE染色检测海马CA1区病理学变化;免疫荧光染色检测小鼠海马CA1区神经元特异核蛋白(NeuN)阳性表达;TUNEL染色检测神经细胞凋亡;酶联免疫吸附试验检测海马CA1区组织中白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-(TNF-)水平;蛋白印迹法检测海马CA1区组织中NMDAR1和CaMK蛋白表达;荧光探针检测海马CA1区Ca2+浓度。结果与对照组比较,ISO组小鼠海马CA1区病理损伤严重,逃避潜伏期延长,神经细胞凋亡率升高,海马CA1区组织中IL-1和TNF-水平升高,NMDAR1和
3、CaMK蛋白表达及Ca2+浓度升高(P0.05),穿越平台次数和NeuN阳性细胞数减少(P0.05);与ISO组比较,Cur-L组、Cur-M组、Cur-H组小鼠海马CA1区病理损伤减轻,逃避潜伏期缩短,神经细胞凋亡率降低,海马CA1区组织中IL-1和TNF-水平降低,NMDAR1和CaMK蛋白表达及Ca2+浓度降低(P0.05),穿越平台次数和NeuN阳性细胞数增加(P0.05),且呈剂量依赖性;NMDA减弱了高剂量Cur对ISO诱导的小鼠POCD的改善作用(P0.05)。结论Cur可能通过抑制NMDAR/Ca2+/CaMK信号通路改善ISO诱导的小鼠POCD。关键词:姜黄素;受体,N-甲基
4、-D-天冬氨酸;钙通道;钙-钙调素依赖性蛋白激酶2型;认知功能障碍;术后认知并发症;异氟醚中图分类号:R285.5,R614.2文献标志码:ADOI:10.11958/20221719Effect of curcumin regulating NMDAR/Ca2+/CaMK signaling pathway on postoperativecognitive dysfunction induced by isoflurane in young miceMA Huimin,LIU Lu,XIONG Ying,ZHAO Hui,KONG FanliAnesthesia Department Op
5、erating Room,Wuhan Childrens Hospital Affiliated to Tongji Medical College of HuazhongUniversity of Science and Technology(Wuhan Maternal and Child Health Hospital),Wuhan 430014,ChinaCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of curcumin(Cur)regulating N-methyl-D-aspartat
6、e receptor(NMDAR)/calcium ion(Ca2+)/calmodulin dependent protein kinase (CaMK)signaling pathway on isoflurane(ISO)-基金项目:湖北省卫生健康委科研立项项目(WJ2019M012)作者单位:华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)麻醉科手术室(邮编430014)作者简介:马慧敏(1983),女,主治医师,主要从事麻醉学方面研究。E-mail:通信作者E-mail:实验研究doi:10.21037/atm-20-5573.19 WANG J,LI R,PENG Z,e
7、t al.HMGB1 participates inLPSinducedacutelunginjurybyactivatingtheAIM2inflammasome in macrophages and inducing polarization of M1macrophages via TLR2,TLR4,and RAGE/NF-B signalingpathwaysJ.Int J Mol Med,2020,45(1):61-80.doi:10.3892/ijmm.2019.4402.20 朴颖,王重阳,宋艺兰,等.朝医麻黄定喘汤对OVA诱导的过敏性哮喘豚鼠模型HMGB1/TLR4/NF-B
8、信号通路的影响 J.中国病理生理杂志,2022,38(5):913-919.PIAO Y,WANG C Y,SONG Y L,et al.Effects of Chao medicine Mahuang-Dingchuandecoction on HMGB1/TLR4/NF-B signaling pathway in guineapig model of allergic asthma induced by OVA J.Chinese Journalof Pathophysiology,2022,38(5):913-919.doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2022.
9、05.018.21 ZHANG H,YANG N,WANG T,et al.Vitamin D reducesinflammatory response in asthmatic mice through HMGB1/TLR4/NF-B signaling pathway J.Mol Med Rep,2018,17(2):2915-2920.doi:10.3892/mmr.2017.8216.(2023-01-16收稿2023-03-16修回)(本文编辑李鹏)948天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期induced postoperative cognitive dysfunc
10、tion(POCD)in young mice.MethodsSeventy-two C57BL/6J mice were separatedinto the control group,the ISO group,the low-dose Cur group(Cur-L group,50 mg/kg),the medium-dose Cur group(Cur-Mgroup,100 mg/kg),the high-dose Cur group(Cur-H group,200 mg/kg)and the Cur-H+NMDA(NMDAR activator)group(200 mg/kg+8
11、mg/kg),with 12 animals in each group.After 30 min of corresponding drug treatment,the mice in the controlgroup inhaled a mixed gas containing 30%oxygen and air for 2 hours,and mice in the other groups inhaled 2%ISO for 2hours,once a day for 14 days.Twenty-four hours after the last treatment,Morris w
12、ater maze test was used to detect thelearning and spatial memory abilities of mice.HE staining was used to detect the pathological changes in hippocampal CA1area.Immunofluorescence staining was used to detect the positive expression of neuron specific nucleoprotein(NeuN)inhippocampus CA1 region of m
13、ice.TUNEL staining was used to detect neuronal apoptosis.Enzyme linked immunosorbentassay was used to detect levels of interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor-(TNF-)in hippocampal CA1 tissue.Western blot assay was used to detect NMDAR1 and CaMK protein expression in mouse hippocampal CA1 tissue
14、.Intracellular Ca2+concentration in hippocampal CA1 region was detected by fluorescence probe.ResultsCompared withthe control group,the pathological damage of hippocampal CA1 region of mice was severe in the ISO group,and the escapelatency was prolonged.The apoptosis rate of neural cells,levels of I
15、L-1 and TNF-,expression levels of NMDAR1 andCaMK protein,and the concentration of Ca2+in hippocampal CA1 region were increased(P0.05).Times of crossingplatform and the number of NeuN positive cells were decreased in the ISO group(P0.05).Compared with the ISO group,pathological damages of hippocampal
16、 CA1 region of mice were alleviated in the Cur-L group,the Cur-M group and the Cur-H group,the escape latency was shortened,and the apoptosis rate of neural cells,levels of IL-1 and TNF-,expressionlevels of NMDAR1 and CaMK protein,and the concentration of Ca2+in hippocampal CA1 region were decreased
17、(P0.05).Times of crossing platform and the number of NeuN positive cells were increased(P0.05),which was dose-dependent.NMDA attenuated the improvement effect of high-dose Cur on ISO induced POCD in mice(P0.05).ConclusionCurcumin may improve ISO-induced POCD in mice by inhibiting NMDAR/Ca2+/CaMK sig
18、naling pathway.Key words:curcumin;receptors,N-methyl-D-aspartate;calcium channels;calcium-calmodulin-dependent proteinkinase type 2;cognitive dysfunction;postoperative cognitive complications;isoflurane术后认知功能障碍(POCD)是接受外科手术的患者在麻醉和外科手术后的严重并发症1。其特点是暂时或永久性认知能力下降、记忆障碍、语言理解和社会适应能力下降2。POCD影响患者的生活质量,还会带来医疗
19、负担3。异氟醚(ISO)是一种临床常用麻醉剂,它可以通过诱导小鼠神经炎症和神经元凋亡,进而导致认知障碍4。因此,任何减轻ISO诱导的神经炎症、神经元凋亡的策略都可能有助于治疗POCD。姜黄素(Cur)是从姜类植物姜黄的根茎中提取的一种不溶于水的黄色酚类物质。已有研究报道,Cur可改善ISO诱导的大鼠认知功能障碍5,但具体机制尚不清楚。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)/钙离子(Ca2+)/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)信号通路对学习与记忆能力具有调控作用。研究显示,NMDAR2-CaMK通路的激活与ISO诱导麻醉小鼠的记忆缺陷相关6。而Cur对ISO诱导的认知功能障碍的改善作用是否与N
20、MDAR/Ca2+/CaMK信号通路有关尚不清楚。本研究主要探究Cur对ISO诱导的幼龄小鼠POCD的影响及其作用机制。1材料与方法1.1实验动物SPF级3周龄C57BL/6J雄性小鼠72只,体质量1416 g,购自广东导科医药技术有限公司,生产许可证号:SCXK(粤)2020-0041。小鼠在温度2124 和湿度为55%60%的饲养环境中自由获取食物和水。本实验已获得本院伦理委员会的批准(伦理号:基础伦审2022-119)。1.2试 剂 与 仪 器Cur(货 号 SND-376,原 料 药,纯 度99.93%,Cur和生理盐水混溶成质量浓度分别为5、10、20 g/L的 混 悬 液)购 自
21、滁 州 仕 诺 达 生 物 公 司;ISO(货 号EPY0000858)、NMDAR激活剂(NMDA,货号M05817)购自深圳振强生物公司;苏木精-伊红(HE)染液(货号AC197L04)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号AC12L055)、Fura-2 AM钙离子荧光探针(货号S1952K)购自上海李记生物科技公司;肿瘤坏死因子-(TNF-,货号MM-0132M1)、白细胞介素-1(IL-1,货 号 MM-0040M1)酶 联 免 疫 吸 附 试 验(ELISA)试剂盒购自杭州铂赛生物公司;兔源一抗神经元特异 核 蛋 白(NeuN,货 号 ab177487)、NMDAR1(货 号ab10
22、9182)、CaMK(货号ab134041)、-actin(货号ab8226)、羊抗兔二抗(货号ab205718)及Dylight 488绿色荧光标记的二抗(货号ab96879)均购自英国Abcam公司。显微镜(型号moticBA210)、酶标仪(型号FK-ZX01)购自宁波舜宇仪器有限公司;蛋白成像系统(型号97701-xx)、显微荧光分光光度计(型号960MC)购自深圳市富彻尔生物科技有限公司。1.3方法1.3.1分组及处理将小鼠按照随机数字表法分为对照组、ISO组、低剂量Cur组(Cur-L组)、中剂量Cur组(Cur-M组)、高剂量 Cur 组(Cur-H 组)、Cur-H+NMDA
23、组,每组 12 只。Cur-L组、Cur-M组、Cur-H组分别在灌胃50、100、200 mg/kg949Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9Cur7(分别为 5、10、20 g/L 的 Cur 混悬液,灌胃体积均是10 mL/kg)的同时腹腔注射8 mg/kg生理盐水,30 min后再吸入2%ISO和28%氧气麻醉2 h8;Cur-H+NMDA组小鼠灌胃200 mg/kg Cur的同时腹腔注射8 mg/kg NMDA9,30 min后吸入2%ISO和28%氧气麻醉2 h;ISO组小鼠灌胃及腹腔注射等量的生理盐水,30 min后再吸入2%ISO和2
24、8%氧气麻醉2 h;对照组小鼠灌胃及腹腔注射等量的生理盐水,30 min后吸入含30%氧气的空气处理2 h10;每天处理1次,处理持续14 d。1.3.2Morris水迷宫实验末次给药处理24 h后,参照文献11 进行实验。(1)学习能力:小鼠置于任一入水点处,将小鼠游到平台的时间记为逃避潜伏期,如果2 min内不能到达平台,就引导小鼠爬到平台,持续训练5 d,记录第6天的逃避潜伏期。(2)空间记忆能力:在第7天时撤去平台,以距平台最远的地方为入水点,观察并记录小鼠在2 min内穿越平台的次数。1.3.3标本收集实验结束后,用颈椎脱臼法处死小鼠,收集小鼠海马CA1区组织。将组织分为两部分,一部
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