关岭牛MSTN基因3’-27-UTR与bta-miR-27b的靶向验证.pdf
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1、【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3端非翻译区(3-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3-UTR序列野生型(WT)和3-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Lucife-rase(
2、H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P0.01,下同),MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3-UTR端的bta-miR-2
3、7b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3-UTR端第6269位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表
4、现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。关键词:关岭牛;MSTN基因;3端非翻译区(3-UTR);bta-miR-27b;双荧光靶向验证中图分类号:S823.81文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)04-1235-09收稿日期:2022-08-14基金项目:国家科技支撑计划项目(2015BAD03B02-3);贵州省农业重大产业科学研究攻关项目(黔教合KY字 2019 011号)通讯作者:许厚强(1957-),https:/orcid.org/0000-0002-4696-5671,博士,教授,博士生导师,主要从事细胞分子生物学及动物育种研究工作,E-mail:第一
5、作者:卢贤君(1995-),https:/orcid.org/0000-0003-1067-815X,研究方向为动物遗传育种与繁殖,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(4):1235-1243ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.028Targeted verification of the relationship between Guanling cattleMSTN gene 3-UTR and bta-miR-27bL
6、U Xian-jun,XU Hou-qiang*,XU Jia-li,RUAN Yong(College ofAnimal Sciences,Guizhou University/Key Laboratory ofAnimal Genetics,Breeding and Reproduction in thePlateau Mountains Region,Ministry of Education/Key Laboratory ofAnimal Genetics,Breeding and Reproduction inGuizhou,Guiyang,Guizhou 550025,China)
7、Abstract:【Objective】This paper clarified the relationship between the binding site and targeted regulation betweenbta-miR-27b and myostatin gene(MSTN)in Guanling cattle,to provide a theoretical basis for improving the meat produc-tion of Guanling cattle by regulating miRNA,and a new entry point to m
8、olecular genetic improvement of local cattles inGuizhou.【Method】The experiment used TargetScan to predict the possible miRNA binding region and potential interac-tion miRNA at the 3-UTR of the bovine MSTN gene,and compared the physiological phenotype,expression differencesof MSTN gene and its 3-UTR
9、end miRNAbetween Guanling cattle and different Guanling cattle hybrids,and then selectedbta-miR-27b to analyze its target site specificity in different Guanling cattle hybrid populations.After that,the MSTN gene3-UTR sequence wild type(WT)and the 3-UTR sequence mutant type(MUT)were cloned into a pMI
10、R-REPORT Luci-54卷南 方 农 业 学 报 12360引言【研究意义】关岭牛(Bos taurus)是我国贵州省的特色畜牧品种之一,皮薄骨细、肉质鲜嫩,但产肉量较低(孙金魁等,2022),如何有效提高其产肉量是推进关岭牛养殖业健康发展的关键。为了兼顾肉质和产肉量,实际生产中通常将关岭牛与其他肉牛品种进行杂交,以获得优良的杂交后代,但该方法较繁琐且养殖成本较高。有研究表明,普通非双肌牛较双肌皮埃蒙特牛产肉量低的原因可能是普通牛肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)含量更高(Miretti etal.,2013),故推测MSTN基因是调控动物肌肉生长的重要基因。因此,分析关岭
11、牛MSTN基因的表达调控关系,寻找与其密切相关的信号调控通路并应用于分子育种方案,对促进优良肉牛品种培育具有重要意义。【前人研究进展】MSTN是肌肉生长的负调节因子,其表达量下调或功能缺失,致使动物出现双肌现象,即肌纤维数量远高于正常个体(Kambadur etal.,1997;龙广丽等,2020)。有研究证实,MSTN基因敲除小鼠的体质量较正常小鼠增长3倍,且肩、臀部的肉质量明显增大,即MSTN基因直接影响动物的产肉性能(McPherron and Lee,2002)。至今,针对牛MSTN基因的研究较多。Azhar等(2020)研究表明,MSTN基因不同HAE II限制性位点的存在是亚齐牛基
12、因多态性的原因,即MSTN基因可作为杂交选育的度量指标。Jakaria等(2021)利用分子生物学技术在不同牛的MSTN基因编码区(CDS)成功鉴定出4个SNPs位点,但这4个SNPs位点不是造成牛正常表型和双肌表型差异的主要原因;同时发现11 bp的碱基缺失会导致MSTN基因片段化。在动物的生长过程中,当蛋白需求不足时MSTN基因表达上调,抑制骨骼肌生长,进而将蛋白供应给代谢需要,这种内生肽关联调控存在于多种动物机体中(Gorssen et al.,2021;Tebbe et al.,2021)。此外,MSTN基因的转录和翻译过程受miRNA调控,miRNA含量对MSTN基因表达的影响较明显
13、(Miretti et al.,2013)。miRNA是一类由DNA转录、长度在22个核苷酸左右的非编码单链RNA分子,miRNA与mRNA的3端非翻译区(3-UTR)的重复序列部分或完全互补,通过二者的相互作用能减弱mRNA的翻译能力或促使mRNA降解,在动植物中参与基因转录后的表达调控(Leeet al.,1993;杨敏等,2021;张小霞等,2022)。McFar-lane等(2014)研究表明,miR-27b能降低MSTN基因的表达,促进卫星细胞激活、成肌细胞增殖及防止肌肉萎缩。Zhang等(2018)研究证实,绵羊卫星细胞内高水平表达的miR-27b能降解MSTN基因mRNA,并抑制
14、其翻译。Ge等(2020)研究发现,通过突变MSTN基因的3-UTR可创建1个mmu-miR-1/206靶点,与mmu-miR-206结合而阻断MSTN翻译,促进成肌细胞的增殖与分化。【本研究切入点】MSTN基因是肌肉生长的负调节因子,而miRNA能显著抑制MSTN基因表达,但miRNA是如何影响MSTN基因表达及是否具有靶向调控作用还有待进一步探究。【拟解决的关键问题】以关岭牛及其杂交牛群体为研究对象,通过双荧光素酶报告基因系统验证bta-miR-27b对MSTN基因的靶向调控关系,以期为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄ferase(H306)vector to
15、 form a dual-luciferase reporter gene vector,which co-transfected with bta-miR-27b in 293T cellsto verify the relationship between bta-miR-27b and MSTN gene expression.And the effects of bta-miR-27b on MSTN geneexpression were confirmed by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】Results show
16、ed that seven potential miRNAbinding sites were found at the 3-UTR end of MSTN gene.The relative expression levels of miRNAs(bta-miR-27a-3p,bta-miR-27b and bta-miR-128)of Guanling cattle hybrid breeds were extremely significantly higher than that of Guanlingcattle(P0.01,the same below),and the relat
17、ive expression level of MSTN gene was extremely significantly lower thanthat of Guanling cattle.But their body weight,body height,body diagonal length,chest circumference and other growthindicators were greatly better than that of Guanling cattle.There were no mutations or losses in the bta-miR-27b
18、bindingregion at 3-UTR end of MSTN gene in Guanling cattle and its hybrid cattle.The fluorescence value of 293T cells co-trans-fected with MSTN-3-UTR(WT)and bta-miR-27b mimics decreased by 53.80%,which was extremely significantly lowerthan that of MSTN-3-UTR(MUT)+bta-miR-27b mimics co-transfection.A
19、fter transfection with bta-miR-27b mimics,bta-miR-27b was successfully overexpressed in Guanling cattle primary myoblast cell line(N2),while the relativeexpression of MSTN gene showed extremely significant downward trend,indicating that bta-miR-27b could inhibit MSTNgene expression.【Conclusion】The b
20、inding region of bta-miR-27b and MSTN gene is located at the 62-69 base of 3-UTR,and the target site is highly conserved.Bta-miR-27b has a strong target regulation effect on MSTN gene,indicating bybta-miR-27b can inhibit MSTN gene expression.Key words:Guanling cattle;MSTN gene;3 end untranslated reg
21、ion(3-UTR);bta-miR-27b;dual-luciferase targetverificationFoundation items:National Science and Technology Support Program(2015BAD03B02-3);Key Scientific Re-search Project of MajorAgricultural Industries in Guizhou(Qianjiaohe KY 2019 011)4期1237牛分子遗传改良工作提供新的切入点。1材料与方法1.1试验材料24月龄健康关岭牛、关岭牛西门塔尔牛杂交混池(关西杂)
22、、关岭牛利木赞牛杂交混池(关利杂)、关岭牛安格斯杂交混池(关安杂)均由贵州关岭牛投资集团关岭牛产业园提供,每组公牛各3头,同时测量牛体质量、体高(地面至髻甲最高点)、体斜长(肩胛骨前缘到坐骨结后缘)、胸围(肩胛骨后缘胸部的圆周长度)及腹围。检疫合格后,颈静脉采血,以肝素钠抗凝管采集并颠倒混匀,防止凝集;同时屠宰采集第10根肋骨处的背最长肌组织。组织样品采集后使用液氮暂存,运回实验室后置于-80 冰箱保存备用。bta-miR-27b mimics(化学修饰的bta-miR-27b抑制剂)委托吉玛生物科技有限公司合成;关岭牛原代成肌细胞株(N2)通过胎牛背最长肌分离自培获得;293T细胞株由中国科
23、学院细胞库提供;pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体购自和元生物技术(上海)股份有限公司;血液基因组DNA柱式中量提取试剂盒(CW0541)购自康为世纪生物科技股份有限公司;LipofectamineTM2000转染试剂(11668019)购自Invitrogen公司;胎牛血清(FBS,10270-106)、DMEM(C11965500BT)和Opti-MEM(31985-070)购自美国Gibco公司;胰酶(Trypsin-EDTA,0458)购自美国Amresco公司;双荧光素酶报告基因系统Dual-Luciferase Reporter Assay System(
24、E1960)购自美国Promega公司。1.2miRNA靶点生物信息学分析及多态性检测通过TargetScan(http:/www.targetscan.org/vert_72/)预测牛MSTN基因3-UTR的miRNA结合位点,选取能与MSTN基因3-UTR端5-CUCAACAAUUUUGAAACUGUGAA-3区域结合的bta-miR-27b进行研究。在NCBI数据库中检索牛MSTN基因(NC_037329.1),使用Primer Premier 5.0设计引物(F:5-AGCCATAAAGGAAGAATCAAG-3和R:5-TAGGAATGGTAACCTGCGTAT-3),委托北京擎科生
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