黄芪甲苷对血管性痴呆大鼠的保护作用及机制探讨.pdf
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1、摇 基金项目:辽宁省教育厅面上项目,项目编号:2021LJKZ0823;大学生创新训练项目,项目编号:202010160126。摇 作者简介:杨文强(1993),男,辽宁锦州人,助理实验师,硕士学位,主要研究方向为神经药理。摇 通讯作者:杨菁(1968),男,辽宁锦州人,教授,博士学位,主要研究方向为神经药理。黄芪甲苷对血管性痴呆大鼠的保护作用及机制探讨杨文强,卢金莹,于露,王高,杨菁(锦州医科大学生命科学研究院公共实验平台,辽宁 锦州 121000)摇 摇 摘要:目的摇 探讨黄芪甲苷(astragaloside IV,AST)对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠的保护
2、作用及其机制。方法摇 50 只雄性 SD 大鼠随机分为假手术组、VD 模型组、AST 组(5、15、45 mg/kg)。采用腹腔注射硝普钠降压后立即夹闭双侧颈总动脉 10 min、随后再通10 min、再夹闭10 min 的方式制备 VD 模型。AST 组于缺血前12、2 h2 次灌胃 AST,各组剂量分别为5、15、45 mg/kg。于术后第7 天开始进行水迷宫实验测定大鼠学习记忆能力。水迷宫实验结束后取大鼠海马测试;HPLC 法测定海马还原型谷胱甘肽含量;免疫组化法观察海马 CA1 区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达;WesternBlot 方法检测磷酸化 NF-资B P65(p-NF-资
3、B P65)蛋白的含量变化;ELISA 法检测海马组织中 IL-1茁、TNF-琢 含量。结果与假手术组相比较,模型组大鼠学习记忆能力明显下降,脑海马组织中 GSH 含量降低,GFAP 与 p-NF-资B P65 表达增加(P0郾 01)。与模型组相比,AST 各组学习记忆能力明显提高,海马组织中 GSH 含量增加(P0郾 01),GFAP 和 p-NF-资BP65 表达下降(P0郾 01)。结论摇 AST 对大鼠 VD 具有保护作用,其作用机制可能与增加大鼠海马组织中的 GSH 含量,提高了大鼠抗氧化能力,抑制星形胶质细胞的过度活化,进而抑制 NF-资B 途径的异常激活,减少炎症细胞因子 IL
4、-1茁 和 TNF-琢 表达有关。关键词:黄芪甲苷;血管性痴呆;NF-资B;GSH;星形胶质细胞中图分类号:R964摇 摇 摇 文献标志码:A摇 摇 摇 文章编号:2096-305X(2023)04-0012-05Discussion on Protective Effect and Mechanism of AstragalosideIV on Rats with Vascular DementiaYang Wenqiang,Lu Jinying,Yu Lu,Wang Gao,Yang Jing(The Public Laboratory Platform of Institue of Li
5、fe Sciences,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000 China)Abstract:Objective摇 To investigate the protective effect and mechanism of astragaloside IV(AST)on rats with vascular demen鄄tia(VD).Methods摇 50 male SD rats were randomly divided into the sham operation group,the VD model group and AST group
6、(5,15,45 mg/kg).The VD model was prepared by clamping bilateral common carotid arteries for 10 min immediately after intraperitone鄄al injection of sodium nitroprusside to reduce blood pressure,followed by another 10 min of ventilation and another 10 min of clam鄄ping.AST group was given intragastric
7、administration twice 12 and 2 h before ischemia,and the doses were 5,15 and 45 mg/kg,re鄄spectively.The learning and memory ability of rats was measured by water maze experiment on the 7th day after operation.After thewater maze experiment,hippocampal test was taken from rats;the content of reduced g
8、lutathione in hippocampus was determined byHPLC;the expression of glial fibrillary acid protein(GFAP)in hippocampal CA1 region was observed by immunohistochemistry;thecontent of phosphorylated NF-资B P65(p-NF-资B P65)protein was detected by Western Blot;the contents of IL-1茁 and TNF-琢 inhippocampus ti
9、ssue were determined by ELISA.Results摇Compared with sham operation group,the learning and memory ability ofrats in model group was significantly decreased,the content of GSH in brain equine tissue was decreased,and the expression of GFAPand p-NF-资B P65 was increased(P0郾 01).Compared with model group
10、,the learning and memory ability of AST group was signifi鄄cantly improved,the content of GSH in hippocampus was increased(P0郾 01),and the expression of GFAP and p-NF-资B P65 wasdecreased(P0郾 01).Conclusion摇 AST has a protective effect on VD in rats,and its mechanism may be related to increasing theco
11、ntent of GSH in the hippocampus of rats,improving the antioxidant capacity of rats,inhibiting the over-activation of astrocytes,in鄄hibiting the abnormal activation of NF-资B pathway,and reducing the expression of inflammatory cytokines IL-1茁 and TNF-琢.Key words:astragaloside IV;vascular dementia;NF-资
12、B;GSH;astrocyte21锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University2023 Aug.44(4)摇 摇 血管性痴呆(VD)是指由于脑血管疾病引起的学习记忆能力下降和认知功能障碍,是第二位常见的认知功能障碍1。VD 是唯一可以预防的痴呆,其中炎症和氧化应激在其形成过程中起着重要作用。研究 VD 的发病机制,对找出早期防治方法具有非常重要意义2。黄芪为豆科植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根,是一味传统的补气药,始载于 神农本草经。其含有的黄芪甲苷(AST)具有抗氧化、抗炎及调节免疫力等多种药理活性。AST 具有减轻大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤,减小缺血再灌引起的脑
13、梗死体积、减轻组织水肿、抑制炎症反应的作用3;还有促进内皮细胞的增殖与迁移、干预炎性细胞黏附、改善血管内皮细胞等功能。AST 对谷氨酸诱导的大鼠海马神经元损伤具有保护作用4。但 AST 对 VD 的影响却鲜有报道。本研究以双侧颈总动脉夹闭再灌注配合腹腔注射硝普钠减压法建立 VD 模型,观察黄芪甲苷对 VD 大鼠学习记忆能力的影响,探讨黄芪甲苷的作用机制,为其开发利用提供理论和实验依据。1摇 材料与方法1郾 1摇 实验动物、主要试剂健康雄性 SD 大鼠50 只,体重250 280 g,购于锦州医科大学实验动物中心。生产许可证号:SCXK(辽)2017-0004。动物实验过程经锦州医科大学实验动物
14、伦理委员会审核并批准,编号2021032101。黄芪甲苷购自成都曼斯特生物科技有限公司,批号:A0273-2022,经 HPLC 检测纯度98郾 0%以上。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary a鄄cidic protein,GFAP)抗体(批号:sc-58766)购自圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Bio鄄technology);p-NF-资B 抗体(批号:AB11014)购自爱必信生物科技有限公司;茁-actin 抗体(批号:AA128)购自碧云天生物技术研究所;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)、ECL 化学发光显色试剂盒、BCA 试剂盒购自北京鼎
15、国昌盛生物技术有限公司;哺乳动物组织总蛋白抽提试剂(批号:AR0101-100)购自武汉博士德生物工程有限公司。TNF-琢、IL-1茁 ELISA 试剂盒购自上海通蔚实业有限公司。5,5忆-二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB),购自百灵威科技有限公司。EG11508 型组织 包 埋 机、RM2255 型 全 自 动 轮 转 切 片 机、DM5000B 型光学显微镜(德国 Leica 公司)。LC-10Avp 高效液相色谱仪(日本岛津公司生产)。SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜装置、凝胶成像系统(BIO-RAD 公司)。1郾 2摇 方法1郾 2郾 1摇 大鼠 VD 模型的制作及分组5:大鼠适应性喂
16、养 3 d 后,进行 Morris 水迷宫学习训练。于训练的第 3 天,选择 4 次均能在 90 s 内找到平台的50 只大鼠为合格实验动物,所有实验动物均符合规定。按照随机原则将大鼠分为假手术组、模型组、AST 组(5、15、45 mg/kg)。每组 10 只,自由觅食饮水,室温 22 益 25 益。模型组大鼠于术前 12 h 禁食,不禁水,腹腔注射 30 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠手术台上,常规消毒,颈正中切口,分离双侧颈总动脉,穿线备用。腹腔注射 2郾 5 mg/kg 硝普钠造成低血压,随即用无创动脉夹关闭侧颈总动脉 10 min 后,放开动脉夹再通10 min,再夹闭
17、10 min,造成大脑的缺血再灌注损伤,再通后缝合伤口,放回笼中保温饲养。假手术组仅分离双侧颈总动脉,腹腔不注射硝普钠,不进行缺血再灌注手术5。AST 各组于缺血前 12、2 h前两次灌胃 AST,各组给药剂量分别为 5、15、45mg/kg。假手术组、模型组灌胃同体积的用于黄芪甲苷溶解的 5%DMSO 水溶液。1郾 2郾 2摇 Morris 水迷宫检测大鼠空间学习能力:实验分为定位航行实验和空间探索实验。水迷宫为直径 120 cm,高 50 cm 的水池,水深 30 cm,水温控制在 22郾 5 益 23郾 5 益。在水池边缘等距离标有 4个入水点,将水池分为 4 个象限,直径 9 cm 的
18、平台位于第一象限中央水下 l cm 处。术后第 7 天开始水迷宫定位航行实验。每天每只大鼠训练 4 次,每次采用不同象限入水点。训练时将大鼠面朝池壁轻轻放入水池,记录大鼠寻找平台所用时间,如果120 s 内没有找到,则将其放置于平台上 10 s。逃避潜伏期记为 120 s,4 次所用时间均值为大鼠当日潜伏期,连续训练 5 d,记录后 3 d 定位航行实验结果。定位航行实验完成次日进行空间探索实验,训练 3 次后,撤除平台,然后从第二象限将大鼠放入水中,记录 120 s 内的游泳轨迹,记录大鼠在平台所在象限的时间,为空间探索实验结果,以检验大鼠的记忆能力。水迷宫实验完成后立即取双侧海马,一侧海马
19、于-80 益冰箱冻存,用于含量测定;另一侧海马于4%多聚甲醛固定,用于组织学实验。1郾 2郾 3摇 海马组织 GFAP 免疫组化染色:海马组织于 4%多聚甲醛中固定 24 h 后,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,进行 CA1 区切片,厚度 7 滋m。利用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)一抗,采用两步法进31杨文强,等:黄芪甲苷对血管性痴呆大鼠的保护作用及机制探讨行 免 疫 组 化 染 色,检 测 胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白(GFAP)表达,DAB 显色,苏木素复染,酒精脱水,二甲苯透明,封片。阳性表达为棕黄色,计数3 个视野下阳性细胞平均数。1郾 2郾 4摇 高效液相色谱法测定还原性谷胱甘肽含量:
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