定向进化Rho1提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金计划项目()微生物代谢国家重点实验室开放课题项目()辽宁省教育厅科研项目()大连市青年科技之星项目()作者简介:谭慧萍 女硕士研究生 主要从事微生物细胞工厂构建:.通讯作者 王亮男讲师博士硕士生导师 主要从事微生物代谢研究:.李倩女副教授博士硕士生导师 主要从事微生物细胞工厂构建和微生物抗逆研究:.收稿日期:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能谭慧萍 王惠国 赵增彤 程杨好 刘晨光 王 亮 李 倩(.大连大学 生命健康学院辽宁 大连.大连工业大学 生物工程学院辽宁 大连.上海交通大学 生命科学与技术学院 微生物代谢国家重点实验室上海)摘 要 燃料乙
2、醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止生产强度严重降低因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标 选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小 酶家族成员 构建易错 产物文库以酿酒酵母 为出发菌株采取“富集自然生长复筛”的筛选策略成功筛选得到两株乙醇胁迫耐受性与发酵性能均提高的突变株 和 测序发现突变株过表达的 序列出现了 个氨基酸的突变和大片段的缺失突变 以/起始葡萄糖进行乙醇发酵 时 和 的乙醇滴度比对照菌株分别提高了.和.超高浓度乙醇发酵能力显著提高 本研究为利用蛋白定向进化方法改良酵母菌复杂表型提供了新的作用靶点关键词 酿酒酵母乙醇胁迫 小 酶
3、易错 超高浓度乙醇发酵中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 ./().()在“碳中和、碳达峰”战略目标背景下发展燃料乙醇这一可再生清洁能源是先进生物质能源转化利用的重要课题 其中超高浓度乙醇发酵(指采用超过(质量分数)的底物浓度得到的产物浓度超过(体积分数)具有更大的经济、环保优势 高终点乙醇浓度会极大降低乙醇精馏能耗和废槽液总量发酵过程还不易污染杂菌 在乙醇发酵菌株的选择上综合考虑乙醇转化效率、菌体回收利用和生物安全等方面酿酒酵母是最为优良的生产菌株 但在发酵过程中酵母菌受到温度、渗透压、纤维素原料降解产生的有毒副产物等环境胁迫因子的影响而
4、且随着终产物乙醇浓度的提高乙醇逐渐成为主要的胁迫因素酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制甚至出现生长停滞和死亡的现象 从过程工程控制角度进行的工艺优化只能部分缓解这种胁迫不能完全弥补酵母菌本身性能下降引发的发酵效率的降低 因此揭示酵母细胞复杂的乙醇胁迫响应机制筛选或构建具有高耐受性高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标 组学的深入分析揭示应对乙醇胁迫细胞整体的转录/翻译水平发生了调整表达水平发生变化的基因数量依据不同乙醇作用方式可达上百甚至上千 乙醇耐受性的多基因、网络化的复杂调控模式意味着传统的单基因操作或单一代谢途径改造难以获得高乙醇耐受性的表型因此研究越来越偏向对细胞整体代谢网络的改造 其
5、中易错 技术是一种简单高效的方法辅以合适的筛选策略可以快速筛选到目的菌株 等应用易错 的方法突变了 聚合酶 转录因子 ()中的 编码基因成功构建了乙醇生产率大幅提高的突变株(约)开创了全局转录调控策略()这一策略的运用还拓展到了多个物种、多种转录起始复合物元件(、因子等)以及环化腺苷酸受体蛋白()、等改造的性状包括乙醇/丁醇耐受性、渗透压耐受性、成膜性等 小 酶家族是酵母形态调节通路中重要的信号分子 以出芽为例 家族的 参与调控了出芽位点选择 家族众多小 酶参与肌动蛋白骨架的极化调控如 和在各个极化过程起核心作用的 家族的 调节从高尔基体向细胞膜的蛋白分泌等 小 酶的功能还涉及协调其他信号转导
6、系统参与多种多样的生命活动如参与雷帕霉素靶 复合物()依赖的信号级联过程和 激酶途径这些信号途径都与细胞响应多种胁迫耐受性密切相关如细胞壁损伤修复、多效药物响应、离子胁迫响应、饥饿及耐热性、渗透压胁迫等 本研究选择 小 酶家族蛋白 作为易错 定向进化的靶点(图)它具有多个效应蛋白、调节了多条代谢途径并且有双元开关(结合 或)的活性调节方式在代谢重塑的过程中起到了关键的调节作用 随机发生的结构基因突变可能扰乱一组上/下游蛋白与小 酶的结合这些蛋白既可能是调节蛋白也可能是小 酶的效应物因而可以在细胞全局水平扰乱代谢网络筛选到含有目的表型的突变株 后续可以结合组学技术分析其重塑的代谢途径和关键基因靶
7、点 材料与方法.材料.菌种和质粒本研究涉及的菌株和质粒如表 所示.培养基(/)培养基:酵母粉 胰蛋白胨 .培养 期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能基:葡萄糖 蛋白胨 酵母粉 酵母高浓度()发酵培养基:葡萄糖 蛋白胨 酵母粉 酵母超高浓度()发酵培养基:葡萄糖 或 蛋白胨酵母粉 固体培养基添加(质量分数)的琼脂表 菌株和质粒 菌株和质粒描述材料来源菌株 、实验室保存.含 质粒本实验构建.含 质粒本实验构建.含 质粒本实验构建 .含 质粒本实验构建 感受态细胞购自 大连质粒 含 抗性基因美国 大学 博士惠赠 酵母表达载体实验室保存 被 取代本实验构建 质粒 插入
8、 表达盒插入质粒 本实验构建 表达盒插入质粒 本实验构建.主要设备与仪器 仪(德国 公司)核酸电泳仪(北京市六一仪器厂)生化培养箱(上海一恒科技有限公司)电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)全温培养振荡器(上海精宏实验设备有限公司)垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)生物传感仪(山东省科学院生物研究所).方法.易错 体系构建 以 基因组为模板/为引物(表)进行常规 反应(产物为)或易错 反应(产物为)易错 使用 ()添加 至 /添 加浓度范围(/):、.、.、.、.、./各添加至 /各添加
9、至 /反应条件:预变性、运行 其后进行变性、退火、延伸的 个循环()之后 延伸 保温 (质量分数)琼脂糖电泳检测 产物确定合适的 浓度.质粒构建以质粒 作为模板/为引物利用高保真 聚合酶()扩增 基因 纯化后的 产物末端加 连入 载体得到 利用 和 双酶切 载体和 连接酶连接胶回收片段得到载体 以酿酒酵母 为模板以/引物扩增酿酒酵母磷酸甘油酸激酶 基因启动子同上连入 载体得到载体 对 和 分别用 /进行双酶切利用 连接酶连接胶回收片段得到载体 上述载体送至华大基因科技有限公司测序验证序列是否正确插入 /双酶切 利用 试剂盒连接)片段构建载体 对照载体 连入 使用的引物序列 微 生 物 学 杂
10、志 卷如表 所示 利用 转化缓冲液(/、/、/、/)制备大肠埃希菌()超级感受态细胞热激法转化连接产物涂布含卡那霉素(/)的 平板以菌落 方法初步筛选阳性克隆并提取质粒进行 /双酶切验证表 引物序列 引物名称引物序列().酵母文库构建、筛选与鉴定 将混合了不同突变位点的 载体文库通过/化学转化法转入酿酒酵母 构建突变菌株文库对照组分别转入 质粒(菌株)和(菌株)转化后所有用到的 液体、固体培养基分别添加/和 /的 平板培养 后添加适量 液体培养基将菌落洗下至摇瓶补加 培养基、/培养 之后(体积比)比例转入含有 (体积分数下同)乙醇的 中震荡培养 /离心 收菌再于 乙醇的 溶液中培养 稀释涂布
11、平板(不含乙醇)挑取直径较大的菌落在 培养基中扩繁、/震荡培养 将上面扩繁的各突变株转接含乙醇的 培养基调至相等的起始 吸光度培养 后定期测定值比较各个突变株生长性状(组平行实验)同时配制含 乙醇的固体 平板将突变株和对照菌株的扩繁菌液梯度稀释()分别取 在平板点样培养 后观察 利用玻璃珠法提取酵母菌含有的游离质粒热激法转化.感受态细胞对提取的质粒进行 和 双酶切验证送至华大基因科技有限公司测序以获得 的突变位点信息与 数据库(.)序列比对并利用 对突变体的蛋白产物进行同源建模(:/./.).突变菌株发酵性能测定以(体积比)比例将过夜培养的酵母菌液转接至 或 发酵培养基(含 /)、/分别震荡培
12、养是 或 定时取样测定 值 同时样品经 /离心 取上清液适当稀释利用 生物传感仪测定发酵液的葡萄糖和乙醇浓度 结果与分析.利用易错 方法定向进化.构建易错 产物文库 选择酿酒酵母 基因作为易错 的靶基因易错 产物质粒文库的构建过程如图 所示 和、一起构成 小 酶家族 与酵母细胞壁完整性密切相关受到细胞周期、细胞表面受体参与的信号转导系统调节可以激活一系列效应蛋白涉及的生物过程包括细胞壁重塑和肌动蛋白骨架发生(出芽、分裂等)、级联效应、囊泡转运蛋白复合体 定位、葡聚糖合酶复合体功能行使等直接影响细胞大小和形态具有多调节因子、多效应蛋白的特点是较为 理 想 的 用 来 实 现 代 谢 扰 动 的
13、中 心 靶 点(图)利用易错 体系的碱基错配、结合筛选手段可以实现蛋白序列的定向进化 改变 反应体系(如引入 、提高 浓度等)可以使 聚合酶在碱基插入时增加错配的频率并且保证非互补链稳定存在 碱基突变如果发生在氨基酸编码区就可能造成原来氨基酸的替换引发蛋白结构和功能的改变 一般 浓度、四种 的比例等都会直接影响到易错 的效率 浓度过高会导致过高的突变率而难以筛选到正突变甚至无法获得 产物 因此本研究首先在 体系中添加不同浓度的(、.、.、.、.、./)使用 聚合酶扩增结果如图 所示 超过./的 将无法获得正常的扩增产物因此 浓度最高选取了 期 谭慧萍等:定向进化 提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高
14、浓度乙醇发酵性能 /图 为常规 体系扩增得到的 片段对比二者可以发现易错 的扩增相比常规 产物特异性降低获得的扩增产物分子量分布较宽且在低分子量区域()存在弥散条带 选取含./和./的 体系分别建立易错 产物质粒文库图 的调节蛋白和效应蛋白.调节因子包括鸟嘌呤核苷酸交换因子(、/和)用于激活 小 酶活化蛋白(、)用于抑制 功能 效应器在建立细胞极性和肌动蛋白细胞骨架重组的生物过程中发挥作用以应对各种类型的细胞壁应激激活细胞壁合成酶调节参与下游转录的蛋白激酶()活性并形成分泌囊泡 可定位于质膜、内体膜或过氧化物酶体膜 (/)().().构建表达载体文库进一步选择 酵母表达质粒为载体骨架构建含 的
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