苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制.pdf
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1、基础研究苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制梁玺,覃淇,张艺馨,袁啸天,吴宁,吴遵秋,吴昌学(贵州医科大学 基础医学院 化学与生物化学实验室,贵州 贵阳 ;贵州医科大学 医学分子生物学重点实验室,贵州 贵阳 )摘要目的探讨苗药验方“四大血”()对类风湿性关节炎()大鼠关节炎症的作用及机制。方法 只健康 大鼠随机均分为空白组、阳性对照组、模型组及 (低剂量)组、(中剂量)组、(高剂量)组,后 组采用型胶原诱导建立 模型,空白组大鼠予等容积生理盐水皮下注射;五花血藤 鸡血藤 见血飞 黑骨藤按 制取受试药,按体质量 、予 高、中、低剂量灌胃,阳性药物组予 雷公藤多苷片()水溶液
2、灌胃,空白组、模型组予等容积生理盐水灌胃,持续周,给药期间检测关节足肿度();干预结束后处死各组大鼠,取膝关节滑膜组织、心脏取血,染色法观察各组大鼠膝关节滑膜组织的形态学特征,酶联免疫吸附试验()检测各组大鼠血清的 表达情况,采用即时聚合酶链式反应()和蛋白质免疫印迹法()检测各组大鼠中 、的 和蛋白表达。结果给药 后,与模型组比较,各给药组大鼠 均不同程度的减轻();染色结果显示,与模型组比较,组大鼠炎症浸润、滑膜增生程度均有改善,且高剂量 组大鼠更明显;与空白组比较,模型组大鼠血清 水平明显升高(),高剂量、中剂量 组和阳性对照组大鼠血清 含量降低();结果显示,与模型组比较,中剂量 组大
3、鼠膝关节滑膜组织中 、明显下调();结果显示,与空白组比较,模型组大鼠膝关节滑膜组织中 、蛋白表达上调(),但中、低剂量 组下调(),且中剂量 组蛋白下调与阳性对照组作用相当()。结论 可抑制 大鼠关节炎症的反应,其机制可能与 炎症体轴激活受到抑制有关。关键词关节炎,类风湿;白细胞介素 ;苗药方四大血;抗炎;炎症体;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 中图分类号 ;文献标识码 文章编号 ():,(,;,)(),(),(),(),()第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 国家自然科学基金();本科创新创业人才培养计划项目(,)贵州医科大学 级硕士研究生通信作者 :;引用本文:
4、梁玺,覃淇,张艺馨,等 苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制 贵州医科大学学报,():,(),(),()()(),(),(),(),()()()(),(),()(),;,;类风湿性关节炎(,),一种炎症性、破坏性、慢性、可侵犯关节滑膜组织的疾病 ,主要特点为多关节滑膜炎性细胞浸润、关节腔内血管翳生成、成纤维样滑膜细胞增殖导致滑膜内衬层增生,最终引起骨组织破坏和软骨退化;临床表现为关节红肿热痛的炎症反应、功能下降、畸形等 ,世界范围内患病率 ,患者年致残率 ,年致残率为 ,现已跃升为医学界的难治疾病 。有研究表明,患者 样受体蛋白 (,)炎症体轴过度激活,将产生相关细胞因子
5、引起一系列的炎性反应,加剧 病情 。炎性体(一种多蛋白复合体),由受体蛋白、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 前体(,)、细胞凋亡相关斑点样 蛋 白(,)部分组成,属于炎性体轴的关键蛋白并参与人体固有免疫 ;当 炎性体激活,形成 斑点或焦亡小体,在自催化活化近距离诱导下,可致 激活,从而促进白细胞介素 (,),等致炎症因子的成熟及分泌,最终导致周围组织炎症反应加重 。在 的药物治疗方面,新的生物制剂如托珠单抗、拮抗剂、肿瘤坏死因子 (,)拮抗剂等,不仅价格高昂,还易发生感染等不良反应;非甾体抗炎药(,)、改善风湿病情药物(,)及糖皮质激素(,)等常用临床治疗药物,则因疗效不佳、不良反应较明显等问
6、题难以达到患者的期望 。当前,从中医药出发,研究疗效更显著、毒副作用更小的新药日渐成为研究热点。苗药验方“四大血”(,)组成为 味藤本药材鸡血藤(仰嗟嘎,)、黑骨藤(莴蒙棱,)、见血飞(嘎龚布梭学,)及五花血藤(梭向,),有通气散血、行瘀止痛之功 。本课题组前期结果表明,给药后的胶原诱导性关节炎模型贵 州 医 科 大 学 学 报 卷大鼠(,)表现出良好的治疗疗效、关节滑膜的炎性细胞浸润可被明显抑制、关节肿胀得到缓解、表达下调 。本研究以 炎症体轴为切入点,通过复刻 模型大鼠,对比不同剂量 治疗前后大鼠关节肿胀度及病理变化,并分析大鼠滑膜组织的 及 的蛋白及 水平和血清 含量的变化,评估 的抗炎
7、效果。材料与方法 实验材料 药材来源 组成药材鸡血藤、黑骨藤、五花血藤及见血飞由贵州中医药大学苗医药教研室提供,经贵州中医药大学田振华副教授鉴定为正品。实验动物 只 周龄、体质量()的健康 ()大鼠,雌雄各半,由学校实验动物中心提供 (黔)。本研究已获得学校实验动物伦理委员会审查批准(),且严格遵守伦理委员会规定。主要药物与试剂雷公藤多苷片(,;黄石飞云制药公司),弗式不完全佐剂(美国 公司),牛型胶原(美国 公司),二喹啉甲酸(,)蛋白定量试剂盒、(,)裂解液、苏木素、及伊红由上海碧云天生物技术有限公司提供,大鼠 酶联免疫吸附实验(,)试剂盒(上海泛柯实业有限公司),大鼠 抗体(美国 公司)
8、,抗体(华安生物技术有限公司),辣根过氧化物酶(,)羊抗兔免疫球蛋白 (,;美国 公司),高灵敏性染料法定量聚合酶链式反应(,)检测试剂盒和逆转录试剂盒由南京诺唯赞生物科技有限公司提供,其余试剂均为进口或国产分析纯产品。研究方法 药物的制备取 苗药五花血藤、鸡血藤、见血飞及黑骨藤组成 ,按 的比例取药材 ,加适量水用大火、中火及小火分别煮 、及 ,合并浓缩液 作为受试药,浓度为 (按生药量计),质量控制标准为每制 ;水煮液原药材五花血藤不低于 、鸡血藤不低于 ,见血飞不低于 及黑骨藤不低于 ;制备完成的中药水煎液密封避光,冰箱备用(保存 周)。造模及分组 只 大鼠于无特定病原体(,)级实验室适
9、应性喂养 ,按体质量随机均分为空白组、阳性对照组、模型组及 (低剂量)组、(中剂量)组、(高剂量)组。取适量 牛型胶原与等量不完全弗氏佐剂于冰上混合,并完全乳化至其滴于水中不扩散;将模型组、阳性对照组及高、中、低剂量 组大鼠于尾根部皮下注射乳化剂 诱导免疫反应,周后再次注射乳化剂 加强免疫;空白组大鼠于尾根部皮下注射同量生理盐水。造模期间每日观察并拍照记录大鼠关节红肿及畸形等情况,每隔 观察并进行关节炎指数评分(,),评分 分即可视为造模成功 。给药方案造模成功 后,高、中、低剂量 组分别按照体质量 、给予 浓缩液 、(按生药量计),阳性对照组按体质量 给予 ,空白组及模型组给予等量生理盐水(
10、,),次 ,持续给药 。一般情况的观察和 评分给药期间观察各组大鼠的饮食量、精神状态、踝关节形态、被毛情况及活动情况等。分别于造模前 天、灌胃给药前 天及灌胃给药 周、周、周时,采用足趾容积测量仪测各组大鼠足趾大小,记录 评分;足趾肿胀指标判断以大鼠造模前后的足趾容积变化为准,双后足累积得分作为总分。标本采集末次给药次日,各组大鼠经 水合氯醛麻醉,麻醉处死大鼠,取仰位固定,沿膝关节正中将皮肤纵行切开、暴露 以膝关节为中心的区域,齿镊提起髌骨,从上缘 处沿两侧向下分离,膝关节腔内可见附着的薄层滑膜组织,呈淡黄色、平滑、光亮,小心剥离后用磷酸盐缓冲液(,)清洗,液氮速冻,保存,并提取滑膜组织的总
11、及蛋白供后续研究。病理组织切片制备取各组大鼠踝关节组织,中性甲醛固定 ,常规梯度脱水后依次进行浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡水化、苏木精 伊红(,)染色,脱蜡水化、脱苯、复水、常规梯度染色、梯度脱水、二甲苯透明、中性树期梁玺等苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制胶封片,在显微镜下观察滑膜组织形态学变化。酶联免疫吸附试验(,)法检测血清 的表达各组大鼠心脏取血后离心并取上层血清,采用 法检测大鼠血清 含量,按照试剂盒说明书进行操作,配置标准品液,每孔分别加标准品和待测样品 ,洗板后加一抗于 放置 ,再次洗板并加酶标抗体于 放置 ),洗板并加底物工作液于 放置 ,最后加终止液并
12、混匀,测量酶标仪 处吸光值。即时聚合酶链式反应(,)法检测滑膜组织 及 的含量取大鼠关节滑膜组织匀浆,利用 法提取总 并吸取澄清的 至新的微型离心管(,)内,依次测定 样品浓度、纯度,逆转录合成互补脱氧核糖核酸(,)并进行 扩增(反应条件:预变性 ,变性 、退火 、循环 次)。用 法计算 的相对表达量,次平行实验后,对目的基因扩增产物与甘油醛 磷酸脱氢酶(,)光密度值进行统计学分析。通过 网站设计引物,由武汉天一辉远生物科技有限公司合成引物,为内参基因,引物序列见表 。表 各基因的引物序列 基因序列()上游:下游:上游:下游:上游:下游:检测滑膜组织 、蛋白表达取各组大鼠关节滑膜组织,置于已加
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