3种抗生素对小菜蛾肠道微生物群落的影响.pdf
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1、河南农业科学,2 0 2 3,52(7):98-10 8Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.07.0103种抗生素对小菜蛾肠道微生物群落的影响李文红,郭涛,向立刚3,余知和,李添群4(1.贵州省农业科学院植物保护研究所,贵州贵阳550 0 8 1;2.长江大学生命科学学院,湖北荆州4340 2 5;3.长江大学农学院,湖北荆州4340 2 5;4.修文县农业农村局,贵州修文550 2 99)摘要:小菜蛾(Plutella xylostella)肠道中有丰富的微生物,易受食物及饲养环境影响。为了
2、解抗生素在饲养过程中对小菜蛾肠道菌群的影响,用氨苄青霉素、硫酸链霉素和利福平3种抗生素浸泡甘蓝叶后饲喂小菜蛾,采用高通量测序技术研究其肠道微生物群落结构的变化。结果表明,小菜蛾肠道细菌主要为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota),肠球菌属(Enterococcus)和肠杆菌属(Enterobacter)为优势属;真菌主要为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和毛霉门(Mucoromycota),优势属为青霉属(Penicillium)。小菜蛾取食不同剂量抗生素浸泡的甘蓝叶后,肠道中子囊
3、菌门相对丰度均上升,厚壁菌门相对丰度均下降;担子菌门在10 mg/L氨苄青霉素处理后相对丰度显著降低,其次是10 0 mg/L硫酸链霉素处理组,其余处理组均上升;毛霉门在10 0 mg/L硫酸链霉素处理后相对丰度显著提升,其次是5mg/L氨苄青霉素处理组,其余处理组均下降;变形菌门在10 0 mg/L硫酸链霉素处理后相对丰度降低,其余处理组均上升;拟杆菌门相对丰度在10 0 mg/L硫酸链霉素处理下上升最多。属水平上,青霉属相对丰度均提升,肠球菌属相对丰度均降低,肠杆菌属相对丰度除10 0 mg/L硫酸链霉素处理组外均增加。取食3种抗生素浸泡的甘蓝叶后小菜蛾肠道真菌群落丰富度、均匀度和多样性均
4、降低,其中10 mg/L氨苄青霉素处理组降幅最大;细菌群落均匀度和多样性增加,其中10 0 mg/L硫酸链霉素处理组增幅最大,群落丰富度经氨苄青霉素和硫酸链霉素处理后增加,而经利福平处理后降低。关键词:小菜蛾;肠道微生物菌群;氨苄青霉素;硫酸链霉素;利福平;高通量测序中图分类号:S433.4Effects of Three Antibiotics on the Gut Microbial Community ofPlutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)LI Wenhong,GUO Tao,XIANG Ligang,YU Zhihe,LI Tian
5、qun*(1.Institute of Plant Protection,Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang 550081,China;2.College of Life Sciences,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;3.College of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;4.Bureau of Agriculture and Rural of Xiuwen,Xiuwen 550299,China)Abs
6、tract:The gut of Plutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)is abundant with microorganisms thatare susceptible to the effects of food and feeding environment.To understand the effects of antibiotics onthe gut flora of P.xylostella during feeding,the changes of the gut microbial community of P.xylo
7、stellaafter cabbage leaves were treated with ampicillin,streptomycin sulfate and rifampicin and used to feed P.xylostella larvae,were investigated using high-throughput sequencing technology in this paper.Theresults showed that the gut bacteria of P.xylostella were mainly Firmicutes,Proteobacteria a
8、nd文献标志码:A文章编号:10 0 4-32 6 8(2 0 2 3)0 7-0 0 98-11收稿日期:2 0 2 2-12-0 8基金项目:国家自然科学基金项目(318 6 0 50 9);黔农科院国基后补助项目【(2 0 2 1)36 号作者简介:李文红(198 3-),女,江西吉安人,副研究员,博士,主要从事昆虫毒理及其抗药性研究。E-mail:通信作者:李添群(197 0-),女,贵州修文人,高级农艺师,本科,主要从事病虫害防控研究。E-mail:第7 期Bacteroidota,and the dominant genera were Enterococcus and Enter
9、obacter.The gut fungi of P.xylostellawere mainly Ascomycota,Basidiomycota and Mucoromycota,and the dominant genus was Penicillium.After treatment with each antibiotic,the relative abundance of Ascomycota all increased,and that ofFirmicutes all decreased.The relative abundance of Basidiomycota signif
10、icantly decreased after 10 mg/Lampicillin treatment,followed by 100 mg/L streptomycin sulfate treatment,while the relative abundanceall increased in other groups.The relative abundance of Mucoromycota significantly increased after 100mg/L streptomycin sulfate treatment,followed by 5 mg/L ampicillin
11、sulfate,while the relative abundanceall decreased in other groups.The relative abundance of Proteobacteria decreased after 100 mg/Lstreptomycin sulfate treatment and the relative abundance all increased in other groups.The relativeabundance of Bacteroidota increased the most under 100 mg/L streptomy
12、cin sulfate treatment.At genuslevel,the relative abundance of Penicillium all increased,the relative abundance of Enterococcus alldecreased,and the relative abundance of Enterobacter increased in all groups except for the 100 mg/Lstreptomycin sulfate treatment.The abundance,evenness and diversity of
13、 the fungal community in the gutof P.xylostella were all decreased for all three antibiotics treatments,with the highest decrease in 10 mg/Lampicillin treatment.The evenness and diversity of bacterial community all increased for all threeantibiotics treatments,with the highest increase in the treatm
14、ent of 100 mg/L streptomycin sulfate.Thebacterial abundance increased for both treatments of ampicillin and streptomycin sulfate,while decreasedfor rifampicin treatment.Key words:Plutella xylostella;Gut microbial flora;Ampicillin;Streptomycin sulfate;Rifampicin;High-throughput sequencing小菜蛾(Plutella
15、xylostella)隶属于鳞翅目菜蛾科,是一种世界性迁飞害虫,主要危害油菜、白菜和萝卜等十字花科作物,对农业生产造成了巨大的威胁!。化学防治因见效快、效果好,一直是小菜蛾防治的主要措施。然而,化学药剂的大量使用使得小菜蛾已对阿维菌素、高效氯氰菊酯、氯虫苯甲酰胺等95种药剂产生了抗药性2-3。作为农业上的重要害虫,小菜蛾一直是国内外的重点研究对象,其种群饲养是研究的基础。当前,主要利用萝卜苗、甘蓝叶、人工饲料及半合成人工饲料饲养小菜蛾4。饲养过程中,小菜蛾也会受诸多病原菌侵染,因而在人工饲料中添加抗生素是饲料保鲜和减少病害侵染的主要措施。昆虫肠道作为外界环境与宿主进行物质交换的重要场所,栖息着
16、数量庞大的微生物群落。这些肠道微生物与宿主互惠共生、相互依赖,在宿主生长繁殖、营养吸收、病害防御、代谢解毒以及抗药性产生等方面发挥着重要作用5-7 。肠道微生物的稳定是昆虫进行正常生命活动的重要前提之一,肠道菌群一旦被打乱便可能导致其宿主的适合度降低18。例如,小菜蛾幼虫在四环素等5种抗生素的作用下其生长发育均受到抑制,预蛹的致畸率、死亡率均增加;在利福平的作用下,白蚁肠道微生物多样性降低,进而影响白蚁产卵量、体质李文红等:3种抗生素对小菜蛾肠道微生物群落的影响对小菜蛾肠道微生物的作用。1材料和方法1.1 材料供试小菜蛾为贵州省农业科学院植物保护研究所昆虫研究室饲养的未接触药剂的单一敏感品系。
17、甘蓝采自贵州省农业科学院田间试验地,种植期间未使用任何药剂。氨苄青霉素(9 6%,#A6920)、硫酸链霉素(8 5%,#S8 2 90)、利福平(95%,#R8011)均采购自北京索莱宝科技有限公司。氨青霉素和硫酸链霉素先用无菌蒸馏水配制成2 0 0 0 mg/L的母液,然后再用无菌水分别稀释至相应浓度。氨苄青霉素质99量和寿命0;抗生素治疗对肠道细菌的破坏可能会增加蜜蜂感染微孢子虫的可能性;土霉素作用可减少大蜡肠道微生物组中四环素抗性基因的多样性2 。由此可见,抗生素的科学、正确使用对昆虫的饲养与防治都十分重要。然而,人工饲料中添加抗生素是否会对小菜蛾肠道微生物菌群产生影响,目前尚缺乏了解
18、。为此,将常见的3种抗生素(氨苄青霉素、硫酸链霉素和利福平)浸泡甘蓝叶后饲喂小菜蛾,利用高通量测序技术对其肠道真菌、细菌群落组成及结构进行研究,以期更好地阐明抗生素100量浓度为5mg/L、10 m g/L,硫酸链霉素质量浓度为100mg/L、2 0 0 m g/L。利福平先用甲醇配制成6 0 0 0mg/L母液,然后再用无菌水分别稀释至3mg/L和6 mg/L。1.2方法1.2.1抗生素剂量设置前期研究发现,蒙氏肠球菌为小菜蛾肠道优势细菌13,室内平板试验测定发现,0.5mg/L氨苄青霉素、2 0 mg/L硫酸链霉素、0.3mg/L利福平即可完全抑制蒙氏肠球菌的生长。本试验采用浸叶法测定抗生
19、素对小菜蛾肠道微生物的影响,设置3种抗生素的质量浓度分别为:氨苄青霉素5mg/L(HP05)、10 m g/L(H P10 0),硫酸链霉素10 0 mg/L(H S10 0)、2 0 0 mg/L(H S2 0 0),利福平3mg/L(H R0 3)、6 m g/L(H R0 6);以无菌水处理为对照。1.2.2小菜蛾幼虫饲养及肠道样品收集将新鲜甘蓝叶分别置于不同质量浓度的抗生素中浸泡30s,取出后晾干至表面无水痕,随后分别放入饲养盒中,接入30 0 头发育状况一致的二龄小菜蛾幼虫,以饲喂无菌水浸泡的甘蓝叶为对照(CK)。饲喂24h后,分别从对照组和6 个处理组中各挑取2 0 0头生长状态一
20、致的幼虫进行肠道组织的收集。先用7 5%乙醇浸泡虫体30 s,随后无菌蒸馏水漂洗3次,然后将幼虫挑至无菌吸水纸上,待体表水分吸干后,解剖收集肠道样品。1.2.3基因组DNA提取、PCR及扩增子测序采用基因组DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek,D5625-O1)提取小菜蛾幼虫肠道微生物总DNA,使用超微量分光光度计(ThermoFisherScientifc,Na n o D r o p2000)检测其质量与浓度。以抽提的DNA为模板,分别采用通用引物515F/806R扩增肠道细菌群落16SrRNA基因V4区,ITS1/ITS2扩增真菌群落转录间隔区ITS1区。PCR反应体系及条件参考
21、前人的方法14-15。扩增产物经检测、纯化后送至北京诺禾致源科技股份有限公司,基于PacBiosequel平台进行3代扩增子测序。1.3数据分析使用FLASH(Version1.2.7)软件对双端序列合并剪接,通过QIIME(Version1.9.1)软件设定条件进行质量过滤控制以获得高质量序列,采用UCHIME算法检测并去除嵌合体序列,最终得到有效数据。使用UPARSE(V e r s i o n 7.0.10 0 1)软件,根据相似度河南农业科学97%对序列进行OTU聚类,筛选每个OTU的代表性序列以进行下一步注释。对于每个具有代表性的序列,基于Mothur算法并采用UNITE和Silva
22、数据库对分类信息进行注释。利用R语言工具绘制物种Venn分析图、群落柱状图等。样品微生物群落Alpha多样性指数(Shannon、Simpson、Ch a o l、O b s e r v e d O T U s、Pi e l o u 和 Goodscoverage)使用QIIME(Ve r s i o n 1.7.0)计算,使用Qimefeature-tablerarefy按最小样本序列数进行样本序列抽平标准化处理,并用R软件(Version2.15.3)显示。主成分分析(PCA)使用R软件中的factoiner软件包和gplot2软件包来减小原始变量的尺寸,并由R软件中的WGCNA包、sta
23、t包和ggplot2包显示。2结果与分析2.1测序深度分析稀释性曲线是用于验证测序数据量是否足以反映样品中物种多样性及丰富程度的重要指标之一16 。由图1可见,7 组样品中真菌群落可观察到的OTU数在测序数据量为10 0 0 0 条时达到平台期,细菌群落在测序数据量为2 50 0 0 条时达到平台期,说明此次测序数据深度已经足够,能够反映样品中大多数的真菌、细菌多样性信息,进一步测序对新OTU的产生贡献不大。2.2数据质控测序原始数据拼接、质控后的信息如表1所示,每组样品中真菌群落高质量序列数在37 7 0 0 80531条,碱基数在96 9396 7 191948 6 5nt,序列平均长度2
24、 11 2 57 bp,平均GC含量为46.2 2%52.25%,测序错误率小于0.0 1(Q20)和0.0 0 1(Q30)的碱基数分别占总碱基数的92.7 2%99.2 0%和86.90%97.02%,有效序列百分比在46.56%94.82%。其中对照组中有效序列百分比和测序错误率明显低于处理组,但序列平均长度明显高于处理组。每组样品中细菌群落高质量序列数在7 0 0 4976254条,碱基数在2 6 8 119 2 3 32 57 0 18 2 nt,序列平均长度为38 3 42 8 bp,平均GC含量为46.8 7%55.15%,测序错误率小于0.0 1和0.0 0 1的碱基数分别占总
25、碱基数的9 6.9 9%9 7.7 8%和9 0.9 8%92.76%,有效序列百分比在8 0.8 4%9 1.6 8%。所有样本测序原始序列均已上传至NCBISRA数据库(登录号:PRJNA898667)。第52 卷第7 期A140120100806040200李文红等:3种抗生素对小菜蛾肠道微生物群落的影响+CK-HP05+HP10*-HS100HS200-HR03-HR06000SZ5.00010015 00020 000101B350F3002502001501005001000CK-HPO5+HP10-HS100HS200HR03HR0630 00040050.00060 00070
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