CpG-ODN对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用.pdf
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1、第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月辐射研究与辐射工艺学报 J.Radiat.Res.Radiat.PVol.41 No.4August 2023CpG-ODN 对重离子 辐 射 所 致 脾 脏 损 伤 的 救治作用张 超1 傅 华1 易永华1 蔡建明2 高 福21(中国人民解放军联勤保障部队第九四医院 放疗科 兰州 730050)2(中国人民解放军海军军医大学 放射医学教研室 上海 200433)摘要 本次研究主要探讨CpG-ODN对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用。实验中C57BL/6L小鼠受到5 Gy 12C6+离子全身照射,在照射后急性期计算小鼠脾脏指数,苏木精-伊红(Hema
2、toxylin-Eosin staining,HE)染色观察脾脏组织结构变化。另外,免疫组化法检测-H2AX蛋白含量以判断脾脏细胞DNA发生双链断裂(Double-strand break,DSB)情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL)法检测脾脏细胞凋亡水平,荧光标记法检测外周血CD19+B细胞数量。结果显示,经12C6+离子照射后CpG-ODN处理,小鼠脾脏指数提高,脾脏红髓萎缩程度减轻,白髓面积增大,其内淋巴B细胞排列密度提高
3、,发生DSB和凋亡的细胞数量减少,外周血CD19+B细胞数量增加。这些表明CpG-ODN能减轻12C6+离子照射后脾脏损伤,其原因可能与CpG-ODN抑制细胞发生DSB和凋亡有关。关键词 碳离子辐射,CpG-ODN,脾脏,凋亡,双链断裂中图分类号 R3DOI:10.11889/j.1000-3436.2022-0116引用该文:张超,傅华,易永华,等.CpG-ODN 对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用J.辐射研究与辐射工艺学报,2023,41(4):040301.DOI:10.11889/j.1000-3436.2022-0116.ZHANG Chao,FU Hua,YI Yonghua,et
4、 al.Effect of CpG-ODN on spleen damage after carbon ion radiationJ.Journal of Radiation Research and Radiation Processing,2023,41(4):040301.DOI:10.11889/j.1000-3436.2022-0116.Effect of CpG-ODN on spleen damage after carbon ion radiationZHANG Chao1 FU Hua1 YI Yonghua1 CAI Jianming2 GAO Fu21(Departmen
5、t of Radiotherapy,The 940 Hospital of Joint Logistic Support Force of PLA.,Lanzhou 730050,China)2(Faculty of Naval Medicine,Naval Military Medical University,Shanghai 200433,China)ABSTRACT The purpose of this study was to explore the ameliorative effect of CpG-ODN on spleen damage after carbon ion r
6、adiation(CIR).In the experiment,C57BL/6L mice were irradiated with 5 Gy of CIR and the index of spleen was calculated.Changes in spleen tissue structure were observed by histological examination(HE).基金资助:甘肃省自然科学基金(22JR5RA003)和国家自然科学基金项目(81501623)资助第一作者:张超,男,1984年出生,2014获得海军军医大学医学博士学位,副主任医师,主要从事肿瘤放射治
7、疗工作通信作者:傅华,硕士,副主任医师,E-mail:收稿日期:初稿 2022-11-10;修回 2023-02-12Supported by Natural Science Foundation of Gansu province(22JR5RA003)and National Natural Science Foundation of China(81501623)First author:ZHANG Chao(male)was born in 1984,and obtained his doctoral degree from Naval Military Medical Univers
8、ity in 2014,associate chief physician,engaged in tumor radiotherapyCorresponding author:FU Hua,master degree,associate chief physician,E-mail:Received 10 November 2022;accepted 12 February 2023辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 2023 41:0403010403012Double-strand break(DSB)of DNA and apoptosis were detected by-H2
9、AX immunohistochemistry and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling(TUNEL)assay,respectively.The number of B cells in the peripheral blood was examined using CD19 antibody labeling.These results showed that CpG-ODN improved the index of spleen,relieved red pulp atrophy,
10、and increased the area of white pulp,in which the number of-H2AX foci and TUNEL-positive cells were decreased after CIR.In addition,CpG-OND increased the number of CD19+B cells in peripheral blood after CIR.These results indicated that CpG-ODN ameliorates spleen damage induced by CIR,possibly by inh
11、ibiting the rate of DSB and apoptosis.KEYWORDS Carbon ion radiation(CIR),CpG-ODN,Spleen,Apoptosis,Double-strand break(DSB)CLC R3重离子是指在元素周期表氦核以后(原子序数大于2)带有正电荷的原子核。当前包括我国在内的多个国家已将重离子应用于放射治疗恶性肿瘤中,并取得良好效果1。然而,重离子所致副反应也日益受到关注。以临床放射治疗中最常使用的12C6+离子为例,首先,因受限于肿瘤体积较大,治疗过程中会采用展宽Bragg峰(Spread-out bragg peak,SOB
12、P)和叠加LET坪区的方法以降低峰坪比,从而提高肿瘤照射体积,但这种方法会使肿瘤周围更多正常组织细胞受到照射损伤;其次,12C6+离子相对生物学效应(Relative biological effectiveness,RBE)是传统光子辐射生物学效应的2.54.5倍,能引起DNA发生双链断裂(Double strand break,DSB),诱导细胞凋亡。因此,重离子对细胞具有比光子更强的辐射损伤作用2-3。脾脏是辐射敏感器官,也是体内重要的免疫器官之一。当脾脏受到辐射损伤后,其内大量以B细胞为主的淋巴免疫细胞数量减少,抗体形成功能抑制,细胞因子网络调节能力失常。临床资料显示,肿瘤患者接受重离
13、子放射治疗后会出现不同程度的免疫器官损伤,导致免疫功能低下,影响自身抗感染和抗肿瘤能力 4-6。因此,减轻重离子辐射所致脾脏损伤具有重要意义。CpG-ODN(Oligodeoxynucleotide)是模拟细菌DNA中非甲基化胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)核心序列而人工合成的一种寡聚核苷酸,可以特异性激活免疫细胞内Toll样受体9(Toll like receptor 9,TLR9)。当TLR9被激活后,其通过MyD88(髓样分化因子,Myeloid differentiation factor 88)依赖性通路介导活化细胞内 NF-B(核因子激活 B 细胞的-轻链,Nuclear factor
14、kappa B)促进细胞存活7。前期细胞试验显示,CpG-ODN 不仅能减少光子辐射导致DNA断裂而形成的微核,还能减轻12C6+离子辐射导致RAW264.7免疫细胞的损伤8-9,近期动物试验发现,CpG-ODN能减轻12C6+离子辐射所致免疫器官胸腺损伤10,本次将以前期试验内容为基础,探讨CpG-ODN对12C6+离子辐射所致免疫器官脾脏损伤的救治作用,为重离子辐射救治研究提供方向,为临床应用提供依据。1 材料与方法1.1 试剂CpG-ODN 由上海生物工程技术有限公司合成,具体序列为:5-TCG TCG TTT TCG GCG CGC CG-3(注:下划线标注的碱基是硫代修饰,其他碱基是
15、磷酸化修饰)。根据要求进行去内毒素处理,PBS(磷酸缓冲盐溶液,Phosphate buffer saline)稀释到浓度为250 g/mL以备用。1.2 动物试验选用C57BL/6L雌性小鼠,体重1618 g,年龄67周。小鼠饲养在中国科学院兰州近代物理研究所动物房内。动物房保持长期通风和自然采光,室内温度控制在23 C左右。小鼠饲料购自兰州大学实验动物中心,饮用水使用商品化纯净水。1.3 12C6+离子照射(Carbon ion radiation,CIR)12C6+离子照射由中国科学院兰州重离子加速器研究装置的深层肿瘤治疗终端提供。照射时小鼠被固定在一个长、宽、高分别为8.0 cm、3.
16、5 cm、3.5 cm的特制透明塑料盒内。由于受到射野能量分区范围限制和为了更好模拟临床放射治疗条件,小鼠置于12C6+离子射线坪区内照射。具体照射参数如下:辐射能量270 MeV;传能密度(Linear energy transfer,LET)值31.3 keV/m;剂量率0.8 Gy/min;吸收剂量5 Gy11。1.4 分组处理试验小鼠随机分成正常组(Normal)、单纯给药张 超等:CpG-ODN 对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用0403013组(CpG-ODN)、照射对照组(CIR control)和照射给药组(CIR+CpG-ODN)。正常组小鼠不进行任何处理;单纯给药组小鼠在指
17、定时间点给予CpG-ODN,但不进行照射;照射对照组小鼠在照射后指定时间点给予等量PBS;照射给药组小鼠在照射后30 min、24 h和48 h连续3次给予50 g CpG-ODN。整个试验过程获得联勤保障部队第九四医院实验动物伦理委员会认可(审批号:2022KYLL207)。1.5 脾脏指数试验小鼠在照射后指定时间点称量体重,然后脱颈法处死,取出完整脾脏进行称重。脾脏指数=脾脏质量(mg)/体重(g)。1.6 HE染色、TUNEL染色和-H2AX免疫组化染色试验小鼠在照射后指定时间点处死,取出的脾脏放置在4%多聚甲醛溶液中室温固定,然后脱水、包埋、切片。使用苏木精-伊红(HE)染色部分石蜡切
18、片,其他石蜡切片邮寄到武汉塞维尔生物有限公司分别进行抗-H2AX免疫组化染色和TUNEL凋亡染色。染色切片在显微镜下观察和拍照。1.7 外周血B细胞检测试验小鼠在照射后指定时间点采用摘眼球法收集100 L外周血,然后加入65 mL 10%甲醛溶液固定,加入1 mL Triton X-100室温孵育30 min,离心后弃上清液,再加入1 mL 50%冰甲醛4 C孵育10 min。荧光染料 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)蓝染所有细胞,CD19单克隆荧光抗体红染淋巴B细胞,取混合均匀的样本滴加在玻片上,在荧光显微镜特定激发光谱下分别计数“蓝染”和“红染”细胞数量
19、并拍照。1.8 统计分析试验数据以“平均数标准差”表示,使用SPSS 13.0统计软件分析数据,独立样本t检验,当*p0.05时表示有显著统计学差异。2 结果2.1 CpG-ODN对12C6+离子照射后脾脏指数的影响前期试验结果显示,CpG-ODN能提高12C6+离子照 射 后 C57BL/6L 小 鼠 存 活 率10。本 次 试 验 中C57BL/6L小鼠同样受到5 Gy 12C6+离子全身照射。在急性期(第1天和第3天)计算小鼠脾脏指数变化以直接反映脾脏萎缩程度和间接反映脾脏免疫功能状态。图1显示小鼠脾脏指数在12C6+离子照射后第1天和第3天分别是正常组的61.9%和46.3%。照射后C
20、pG-ODN处理,脾脏指数在第1天和第3天分别为正常组的 83.6%和 59.5%。这表明在小鼠受到12C6+离子照射后脾脏出现萎缩并持续性加重,而CpG-ODN能抑制脾脏萎缩,间接说明其具有减轻免疫功能损伤的作用。2.2 CpG-ODN对12C6+离子照射后脾脏组织结构的影响C57BL/6L 小鼠受到 5 Gy 12C6+离子全身照射后,镜下观察HE染色后脾脏组织结构变化以评估损伤程度。图2(a)结果显示,正常脾脏组织内红髓(Red pulp,R.P.)和白髓(White pulp,W.P.)分界清楚,白髓内含丰富淋巴细胞,排列致密。12C6+离子照射后脾脏组织出现红髓萎缩,结构破坏,血管窦
21、扩张充血,颜色变浅,白髓面积缩小,其内细胞排列稀疏。照射后CpG-ODN处理,红髓萎缩程度减轻,白髓面积相对增大,细胞数量有所提高,排列较密集。图2(b)定量结果显示,正常脾脏中白髓占比例为48.3%,12C6+离子照射后第1天和第3天白髓占比缩小到19.7%和11.8%。照射后CpG-ODN处理,脾脏白髓占比在第1天和第3天分别为29.4%和20.1%。这表明小鼠受到12C6+离子照射后脾脏组织萎缩,结构破坏,而CpG-ODN能减轻照射后白髓萎缩程度,缓解脾脏损伤。图1CpG-ODN对12C6+离子照射后脾脏指数的影响小鼠脾脏指数在12C6+离子照射后第1天和第3天的变化情况*p0.05,与
22、照射对照组比较Fig.1Effects of CpG-ODN on spleen index after CIR.the change of spleen index after CIR at the 1st and 3rd day;*p0.05,compared with CIR control group辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 2023 41:04030104030142.3 CpG-ODN对12C6+离子照射后脾脏细胞DNA断裂和凋亡的影响C57BL/6L 小鼠受到 5 Gy 12C6+离子全身照射后,免疫组化法检测-H2AX蛋白表达水平,以判断脾脏细胞DNA发生DS
23、B的情况,同时TUNEL法检测脾脏细胞发生凋亡的数量。图3(a)中免疫组化结果显示,小鼠受到12C6+离子照射后脾脏白髓内-H2AX阳性细胞数量增加。照射后CpG-ODN处理组,其内-H2AX 阳性细胞数量减少,平均数量从162个降低到53个。图3(b)中TUNEL法检测结果与-H2AX免疫组化法检测结果基本一致。图2CpG-ODN对12C6+离子照射后脾脏组织结构的影响:(a)HE染色观察小鼠受到12C6+离子照射后脾脏第1天和第3天结构变化;(b)定量分析脾脏白髓占比;*p0.05,与照射对照组比较Fig.2Effects of CpG-ODN on spleen damage after
24、 CIR:(a)representative of histological specimens of spleen after CIR at 1st and 3rd day;(b)proportion of white pulp in spleen was quantified;*p0.05,compared with CIR control group图3CpG-ODN对12C6+离子照射后脾脏细胞DNA发生DSB和凋亡的影响:(a)免疫组化法检测小鼠受到12C6+离子照射后脾脏白髓内细胞-H2AX蛋白的表达;(b)TUNEL法检测小鼠受到12C6+离子照射后脾脏白髓内凋亡细胞的数量Fig
25、.3Effects of CpG-ODN on DNA DSB and apoptosis of spleen cell after CIR:(a)expression of-H2AX protein in spleen was detected by immunohistochemistry after CIR;(b)the number of apoptotic cells in spleen was detected by TUNEL assay after CIR张 超等:CpG-ODN 对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用0403015小鼠受12C6+离子照后脾脏白髓内出现大量TUNE
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