一株动物源乳酸菌的胞外产物免疫原性研究_刘少杰.pdf
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1、今日畜牧兽医1xperimental study on onlineE实验研究一株动物源乳酸菌的胞外产物免疫原性研究刘少杰1,杨红亚1,张异岗1,段美玲4,于莉莉1,张金朝1,康梓哲2,康社强2,陆 安1,3(1.石家庄九五堂生物科技有限公司 052160;2.河北诺达生物科技(赞皇)有限公司 051230;3.石家庄燕科生物科技有限公司 050200;4.青岛市市级公园管理服务中心 266033)摘要:以乳酸菌的胞外产物(ECP)为此次试验研究对象,经过对 L-2 ECP 的提取,制备 ECP 疫苗,给小鼠免疫后,通过脾淋巴细胞增殖试验、间接 ELISA 测血清 IgG 水平以及致病菌攻菌保
2、护试验,来对L-2 ECP的免疫原性进行探究。结果表明:ECP 疫苗不仅可以刺激小鼠机体产生细胞免疫,还可以诱导产生较高水平的体液免疫,降低致病性大肠杆菌对小鼠的致死率。结论:L-2 ECP 具有较好的免疫原性,可刺激小鼠机体同时产生细胞免疫和体液免疫,对小鼠有一定的相对保护效果。关键词:乳酸菌;胞外产物;免疫原性乳酸菌作为一类能产乳酸,革兰氏阳性,兼性厌氧的益生菌,其种类繁多,被广泛应用于人的食品行业、动物饲料添加剂、日化用品以及保健品当中。乳酸菌作为消化道常在菌群之一,它与人和动物的健康息息相关1,据有关报道乳酸菌可以促进动物机体的消化吸收能力,在肠道中具有抢占作用位点从而来抑制有害菌的生
3、长使肠道菌群达到稳定的生理活性。除此之外还有学者研究表明,乳酸菌不仅可以稳定机体的肠道微生态环境,还可以帮助机体增强免疫防御能力,激活巨噬细胞、促进淋巴细胞增殖从而提高机体的特异性和非特异性免疫,从而达到抗炎、防癌变的效果2。胞外产物(Extracellularproducts,ECP)是指细菌在培养过程中分泌出来的代谢产物和活性物质的总称3,其主要成分包括脂类、有机酸、糖类、生物碱、细菌素等,目前已有较多关于致病菌 ECP 的研究,包括大肠杆菌、巴氏杆菌、单胞菌等,研究表明 ECP 具有不同程度的致病性以及良好的免疫原性,可以为动物机体提供可靠的免疫保护屏障4,本试验以乳酸菌ECP 为试验材
4、料,对其免疫保护效果进行评价以及作用机理进行初步探索。1 材料与方法1.1 试验材料乳酸菌分离株 L-2 分离于鸡肠道中,致病性大肠杆菌分离株 EC-CL 分离于病死狐肝脏内,L-2、EC-CL 都经基因序列比对鉴定为乳酸菌、大肠杆菌。试验动物昆明鼠,购于北京维通利华试验动物技术有限公司,试验前经过预饲养未发现异常情况。主要试剂仪器:MRS 肉汤青岛海博营养肉汤青岛海博BCA 试剂盒Thermo弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂SIGMAMTT 试剂盒碧云天(Beyotime)青链霉素双抗液SolarbioConASolarbio细胞培养板Thermo胎牛血清(FBS)Thermo1640 基础培养
5、基Thermo红细胞裂解液Thermo超声波细胞破碎仪(HN-1000Y)上海达洛科学仪器有限公司酶标仪(Infinite M200 Pro)瑞士 TecanIX53 倒荧光倒置显微镜奥林巴斯CO2培养箱Thermo微电脑培养箱(SPX-300B-G 型)上海博讯实业有限公司医疗设备厂1.2 L-2 ECP 的提取参考文献5使用饱和硫酸铵沉淀法制备 L-2ECP。首先挑取在固体培养基上活化好的单菌落接种到 1LMRS 液体培养基中,37静置培养 24h 左右,将菌液 6500r/min 低温离心10min,收集上清液,用 0.22m 滤器过滤除菌,之后使用饱和硫酸铵 4沉淀过夜。6500r/m
6、in 低温离心 10min,留沉淀并用无菌中性 PBS 重悬,之后利用透析袋将重悬液中的硫酸铵除去,使用PEG-20000将ECP浓缩,最后对ECP进行菌检,-20备用。1.3 L-2 ECP 蛋白总含量的测定采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白含量。1.4 L-2 ECP 致病性检测选取健康昆明鼠 30 只,随机分成 6 组,5 个重复/组,设置 5 个试验组和 1 个对照组,试验组分别腹腔注射浓度为230g/mL2倍比稀释至14.375g/mL浓度的无菌ECP0.2mL/只,对照组注射等体积的无菌生理盐水,连续观察 1 周,记录各组小鼠的异常情况。1.5 EC-CL 半数致死量的
7、测定挑取 EC-CL 单菌落接种于营养肉汤培养基中,37摇菌培养至对数期,10000r/min 离心 2min,弃上清,无菌生理盐水冲洗菌泥,计数菌落,调整菌液浓度从 1.6109CFU/mL10 倍比稀释至 1.6105CFU/mL,腹腔注射小鼠,5 只/组,0.2mL/只。利用寇氏法测定 EC-CL 半数致死量。1.6 L-2 ECP 蛋白疫苗的制备将 ECP 使用无菌 PBS 调整到需要的使用浓度,将 ECP 进行水浴灭活后与等体积的弗氏佐剂加入离心管中,将两种液体进行充分的搅拌震荡使其乳化,搅拌震荡 15min 左右,察看乳化效果(乳化液滴在水面不散开为宜)。小鼠第一次免疫使用弗氏完全
8、佐剂制备疫苗。剩下两次免疫时使用弗氏不完全佐剂制备疫苗,制备方法同第一次。1.7 L-2 ECP 蛋白疫苗免疫小鼠将 50 只健康昆明母鼠,随机分为两组,25 个重复/组。分为 ECP 免疫组(a)和对照组(b)。第一次免疫:将含有基金项目:河北省引进国外智力项目“动物源乳酸菌筛选分离鉴定与替抗微生态制剂的研究”;河北省重点研发计划项目乡村振兴技术创新专项“畜禽粪污智能发酵工艺装备及高效除臭保氮菌剂的开发与应用”,项目编号 223222909D作者简介:刘少杰(1996-),男,河北石家庄人,兽医师,硕士研究生,主要从事微生态菌株筛选与发酵研究工作通信作者:陆安(1982-),男,河北石家庄人
9、,高级兽医师,硕士研究生,主要从事微生态与中药科研及发酵工艺研究工作2xperimental study on onlineE实验研究60gECP 的乳化疫苗经皮下多点注射给(a)组小鼠进行疫苗免疫;(b)组小鼠皮下注射等量 PBS 与弗氏佐剂乳化的疫苗进行免疫;第一次免疫后第 14 天,使用弗氏不完全佐剂疫苗进行第二次免疫;第一次免疫后的第 3 周按照第二次免疫方法进行第三次免疫。1.8 血清采集第一次免疫前各分组随机挑选 3 只小鼠,摘眼球采血离心取血清作为对照。之后每隔 1 周各组进行一次采血取血清,3 只/组,连采 4 周。采集的新鲜血液置于 37培养箱中让其血清快速析出,2500r/
10、min 离心 15min,取血清于无菌离心管中,-20冻存备用。1.9 脾细胞制备随机从(a)、(b)两组各取 3 只小鼠,脱颈处死,剖取脾脏用于脾细胞的制备。首先将取出的脾脏置于无菌容器中,针刺脾脏,用灭菌 PBS 将脾细胞吹出,得到细胞悬液。细胞悬液2500r/min,离心 8min,弃上清,用 1mL 细胞裂解液将沉淀重悬后再次离心,之后用 PBS 将裂解液洗脱干净,离心留沉淀,最后使用 1640 血清双抗的培养基将细胞重悬并作适当稀释,显微镜下计数脾细胞。1.10 淋巴细胞增殖试验在 96 孔细胞板中,每份脾细胞悬液重复 9 孔,100L/孔,每份细胞的前 3 孔加入 10g/mL 的
11、 ConA10L/孔,作阳性对照组;中间 3 孔加入 10g/mL 的 ECP10L/孔,作为试验组;最后 3 孔加入单纯 1640,作为阴性对照组;37厌氧培养相中培养 3d,使用 MTT 试剂盒法,在 OD570nm 下测其吸光值,并计算刺激指数。刺激指数(SI)=(试验组 ConA 和 ECP 刺激平均 OD 值-培养液平均 OD 值)(试验组未刺激平均 OD 值-培养液平均 OD 值)。1.11 间接 ELISA 测定免疫小鼠血清 IgG 水平EC-CL 全菌蛋白制备:将 EC-CL 接种到营养肉汤平板上培养,待长出单菌落后,挑单菌落接种到 15mL肉汤液体培养基中,37震荡培养12h
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