根际溶磷伯克霍尔德菌Par...pp.对马尾松苗的促生作用_徐红云.pdf
《根际溶磷伯克霍尔德菌Par...pp.对马尾松苗的促生作用_徐红云.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《根际溶磷伯克霍尔德菌Par...pp.对马尾松苗的促生作用_徐红云.pdf(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):274-285收稿日期:2022-10-08基金项目:国家自然科学基金项目(32160375),贵州省科技计划项目(黔科合基础2022一般 210)作者简介:徐红云,女,博士,讲师,研究方向:资源微生物、林木抗逆育种;E-mail:通讯作者:于存,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:林业资源微生物开发与利用;E-mail:根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用徐红云1 吕俊2 于存2(1.贵州民族大学生态环境工程学院,贵阳 550025;2.贵州大学林学院,贵阳
2、550025)摘 要:为筛选溶磷效果较好的根际细菌(phosphate-solubilizing rhizobacteria,PSB),并明确其对马尾松苗的促生效果和作用机制。利用土壤稀释平板法进行 PSB 菌株的分离和纯化,通过形态学和 16S rDNA 分子测序等方法进行 PSB 菌株的鉴定,最后将PSB 菌株接种至马尾松苗,培养 60 d 后测定马尾松苗生长、生理、苗根际土壤理化性质和根际细菌群落结构和组成。结果表明:由马尾松根际土中分离获得溶磷能力较强的 3 个 PSB 菌株 WJ10、WJ25 和 WJ41 均为伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.;3 个 PSB
3、菌株对磷酸铝的增溶能力最强,其次是磷酸三钙、磷酸氢钙和磷酸铁;盆栽试验表明,3 个 PSB 菌株均可促进幼苗的生长,其中WJ25 对苗高、根长的促进效果最明显,WJ41 和 WJ10 次之。3 个 PSB 菌株对苗促生的主要机制包括,PSB 提高了马尾松苗的根系活力、叶绿素 b、可溶性蛋白等生长指标及氮、磷和钾等养分含量;同时,提升了根际土有效磷、速效钾、活性氮、土壤养分含量、土壤酶活性;此外,3 个 PSB 菌株的添加还影响了马尾松苗根际细菌群落的组成和多样性,促进了 Bacillus、Nitrosospira、Gemmata和 Cytophaga 等有益菌在根际土壤中的显著富集。综上,本研
4、究筛选获得的 3 个溶磷伯克霍尔德菌,它们能够通过调控植物生理及改变根际微环境从而促进马尾松苗的生长。通过本研究,为马尾松根际溶磷细菌菌肥的开发和应用提供了理论依据。关键词:根际溶磷细菌;促生;伯克霍尔德菌;马尾松;根际微生物DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1226Growth Promoting of Pinus massoniana Seedlings Regulated by Rhizosphere Phosphate-solubilizing Paraburkholderia spp.XU Hong-Yun1 LV Jun2 YU Cun2
5、(1.College of Eco-Environment Engineering,Guizhou Minzu University,Guiyang 550025;2.College of Forestry,Guizhou University,Guiyang 550025)Abstract:It is aimed to screen phosphate-solubilizing rhizobacteria(PSB)and to clarify its growth-promoting effect on Pinus massoniana seedlings and the mechanism
6、.The soil-dilution plate method was used to isolate and purify the PSB strains.The PSB strains were identified by morphology and 16s rDNA sequencing methods.Finally,the masson pine seedlings were inoculated with PSB strains for 60 d,then the seedling growth and physiological indexes,soil physical an
7、d chemical properties,and rhizosphere bacterial community were determined.The results showed that three PSB strains(WJ10,WJ25 and WJ41)with strong phosphate-solubilizing abilities were isolated from the P.massoniana rhizosphere soil and belonged to Paraburkholderia spp.The three PSB strains had the
8、strongest phosphate-solubilizing abilities to aluminum phosphate,followed by tricalcium phosphate,calcium monophosphate and ferric phosphate.Based on the pot experiment,the three PSB strains effectively promoted seedlings growth,with the best effects on the seedling height and root length promotion
9、for WJ25,followed by WJ41 and WJ10.The main mechanisms of seedling promotion of the three PSB strains include:1)The PSB strains increased the root activity,chlorophyll b,soluble protein,nitrogen,phosphorus and potassium contents in masson pine seedlings;2)meanwhile,PSBs enhanced 2023,39(6)275徐红云等:根际
10、溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用磷是植物生长发育过程中的基本营养素,尤其是在幼苗生长的早期阶段1。尽管土壤中含有足够的磷,但植物只能获得极少量的磷,因为大多数土壤磷通过与钙(Ca2+)、铝(Al3+)和铁(Fe3+)等金属离子结合而转化为难溶的形式2-4。在中国,约有 95%土壤中的磷是难降解的磷形态,这大大限制了植物的健康发展5。克服这个问题的通常做法是使用化学磷肥。然而,频繁地投入化肥,投入成本增高的同时,也会恶化土壤健康,例如土壤压实、侵蚀、退化、生物多样性丧失和土壤微生物活性下降6。此外,由于磷肥是一种不可再生资源,如何有效减少目前磷肥的
11、浪费,回收土壤中的磷资源也非常重要。溶磷细菌(PSB)可以通过酸化、螯合、交换反应和产生有机酸等将不溶性磷酸盐转化为植物可用磷的形式7-8。此外,它们还可以促进植物有益微生物群落的生长,提高土壤微生物活性9。使用 PSB 提高土壤磷可用性不仅可以减少化学肥料的用量,而且还可以减少因过量施用磷肥而造成的环境污染10。迄今为止,已经报道了许多 PSB 菌株,包括重要的属:气球菌属 Aerococcus、农杆菌属Agrobacterium、节杆菌属 Arthrobacter、芽孢杆菌属Bacillus、Delftia 属、肠杆菌属 Enterobacter、欧文氏菌属 Erwinia、黄杆菌属 Fl
12、avobacterium、克雷伯菌属 Klebsiella、微球菌属 Micrococcus、伯克霍尔德菌属 Paraburkholderia、假单胞菌属 Pseudomonas、根瘤菌属 Rhizobium 和黄杆菌属 Xanthobacter 等4-5,11。然而,大多数 PSB 都是由农作物的根际分离出来的,相比之下,由木本植物的根际土壤中分离 PSB 和应用的报告较少5。马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是中国南方造林的重要用材树种之一12-13。仅以贵州省为例,该省的马尾松栽植面积占全省 287 万 hm2松林面积的 1/4-1/3。贵州是典型喀斯特地区,该省的土
13、壤缺磷是一直以来阻碍马尾松人工林健康生长的重要因素14。虽然以往有较多报道利用菌根菌改良土壤磷进而促进马尾松生长的报道,但大部分菌根菌存在生长缓慢和易受环境因素影响的特点15。因此,在自然界中挖掘生长速度快且受环境因素干扰小的PSB 菌株,对解决磷限制马尾松生长发育具有重要意义。本研究在贵州省的健康马尾松根际土壤中分离和筛选高效 PSB 菌株;评价 PSB 对不同难溶性磷酸盐的溶磷能力;测试 PSB 菌株对马尾松苗生长、生理、土壤理化性质、根际微生物群落变化的影响,进而初步揭示 PSB 菌株对马尾松苗促生的作用机制。通过本研究为马尾松根际溶磷微生物肥料的开发和应用提供理论依据。1 材料与方法1
14、.1 材料1.1.1 供试土壤样品 土壤样品采集于贵州省贵阳市 20 年生的健康马尾松的根际,采集马尾松根系(直径小于 0.5 cm)后,轻轻摇动去除根上松散黏附的土壤,将根 4 mm 内紧密黏附的土壤(视为根际土壤)置于无菌塑料袋中,用于分离 PSB 菌株。1.1.2 供试种子 试验所用马尾松种子购买自贵州省都匀市马尾松林木良种基地。1.1.3 培养基 Pikovskaya(PVK)培养基:C6H12O6,10 g;Ca3(PO4)2,10 g,NaCl,0.3 g;KCl,0.3 g;MgSO47H2O,0.03 g;(NH4)2SO4,0.5 g;Mn-SO44H2O,0.03 g;Fe
15、SO47H2O,2.03 g;琼脂,20 g;蒸馏水,1 000 mL;pH 值,7.0;LB 琼脂培养基:胰蛋白酶,10 g;酵母提取物,5 g;NaCl,10 g,琼脂,20 g;蒸馏水,1 000 mL;pH 为 7.0。4 种不同磷源培养基:以 Ca3(PO4)2作为磷源的PVK 液体培养基;将 PVK 液体培养基中的 Ca3(PO4)2分别替换为 11.03 g/L 的 CaHPO42H2O、12.03 g/Lthe contents of available phosphorus,available potassium,active nitrogen,soil urease and
16、 phosphatase in rhizosphere soil;3)in addition,the addition of three PSB strains also affected the composition and diversity of the rhizosphere bacterial community,and promoted the significant enrichment of beneficial bacteria such as Bacillus,Nitrosospira,Gemmata and Cytophaga in the rhizosphere so
17、il.In conclusion,the three Paraburkholderia spp.strains could promote masson pine seedlings growth by regulating plant physiology and changing rhizosphere micro-environment.This study provides a theoretical basis for the development and application of rhizosphere PSB fertilizer of P.massoniana.Keywo
18、rds:phosphate-solubilizing bacteria;growth promotion;Paraburkholderia spp.;Pinus massoniana;rhizosphere microbiome生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6276的 FePO47H2O 和 7.90 g/L 的 AlPO4分别作为另外 3种不同磷源的培养基。1.2 方法1.2.1 马尾松根际溶磷细菌的分离和纯化 1.2.1.1 根际溶磷细菌的分离 将 10 g 供试土壤加入到装有 10 mL 无菌水的 50 mL 三角瓶中,在 120
19、 r/min 的摇床上振荡 20 min 后,静置 10 min 得到 0.1 g/mL 的土壤稀释液,之后对此稀释液依次进行稀释,得到 10-2、10-3、10-4、10-5 g/mL 的土壤稀释液。然后分别将 10-3、10-4、10-5 g/mL 的稀释液涂布于 PVK培养基上,分离和纯化 PVK 培养基上产生明显透明圈(溶磷圈)的菌株作为高溶磷菌株的筛选。1.2.1.2 溶磷菌株溶磷能力的测定 将分离纯化的菌株分别接种至 PVK 固体培养基,通过测定透明圈直径(D)和菌落直径(d)计算溶磷指数(P solubilization index,PSI);将分离纯化的菌株接种于含有 100
20、mL PVK 液体培养基的 250 mL 三角瓶中,在转速为120 r/min、30培养5 d后,4下8 000 r/min离心 10 min,收集上清液。使用抗坏血酸法测量失活菌株接种培养后可溶性 P 含量(AP0)和活性菌株接种培养后可溶性 P 含量(AP1),并计算溶磷率(PSR)。PSI 和 PSR 的计算方法如下:PSI=D/dPSR(%)=(AP1-AP0)/AP0100%1.2.2 根际溶磷细菌的鉴定 1.2.2.1 菌株形态学鉴定 参考常见细菌系统鉴定手册16进行菌株形态学的观察和生理生化的测定。并参考 Shen 等17方法对菌株进行电镜扫描 观察。1.2.2.2 16S rD
21、NA 基因的分子鉴定 使用 XPure 土壤 DNA 提取试剂盒(中国成都兴白鸡生物技术有限公司)提取 PSB 菌株的总 DNA,采用细菌 16S rDNA通用引物27F(5-AGATTTGATCTGGCTCAG-3)和 1492R(5-GGTTACTTGTTACGATT-3)进行 16S rDNA 序列扩增18。PCR 产物纯化后送往中国成都新百济生物科技有限公司进行测序。将所得序列与GenBank 中的序列进行比较,使用 MEGA(v.7.0)软件通过 Neighbor Joining(NJ)方法构建系统发育树,鉴定完成后将分子序列提交至 GenBank,获取登录号。1.2.3 根际溶磷细
22、菌对 4 种难溶性磷源的溶磷能力及 pH 变化 根据 1.2.1 中描述的方法,将溶磷效果较好的 3 个溶磷菌株(108 CFU/mL)分别接种于含有 4 种不同磷源的培养基中,并在 30、120 r/min上孵育 168 h。期间,每 24 h 吸取 1 mL 培养液,用于 P 溶解量(PSC)和 pH 值的测定,PSC(mg/L)=(AP1-AP0)。1.2.4 根际溶磷细菌对马尾松苗生长、生理及土壤理化性质的影响 试验处理:马尾松种子在 0.4%高锰酸钾溶液中浸泡 30 min 后,用无菌水洗涤 5 次后,然后平铺于无菌蛭石上,在室温下放置两周后,选择生长一致的马尾松幼苗,移植到装有灭菌
23、土壤(马尾松林下土经 121高温高压灭菌 2 h)的塑料盆中,每盆栽植 3 棵幼苗。之后用 LB 液体培养基 10 mL细菌悬液(108 CFU/mL)接种到栽有马尾松苗的穴盆中。以相同体积灭活的细菌悬液作为对照。每个处理有 36 个穴盆。样品收集:以上处理幼苗在培养 60 d 后,将 12个穴盆的苗作为 1 个生物学重复进行生长指标的测定。同时收集新鲜的苗,迅速用液氮冷冻后于-80冰箱保存用于苗生理指标和植株养分含量的测定。收集不同处理苗根周围的土壤(2 mm 范围内),用于土壤理化性质、土壤酶活和根际细菌群落的测定。指标测定方法:幼苗高度、主根长度用卷尺测量,用电子天平测定鲜重。按照 Li
24、 等8描述的程序测定干重。根系活力根据 Yin 等19的方法测定。根据 Zhang 等20的方法测定可溶性糖含量和叶绿素含量。根据 Chu 等21的方法,使用考马斯亮蓝G250 测定可溶性蛋白质含量。用 5 mL 浓 H2SO4和H2O2消化细磨的幼苗样品后,分析植物的总 N、总P 和总 K 含量22。根据标准方法23确定土壤化学性质,包括全氮、全磷、全钾、水解氮、有效磷和速效钾。3 种土壤酶(脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶)的活性按照 Lemanowicz 等24提出的方法测定。参考 Yu 等12的方法进行马尾松苗根际细菌群落的高通量测序和数据分析。使用 EZNA 土壤 DNA 试剂盒(Omega
25、 Bio-Tek),提取土壤总 DNA。使用通用引 物 341F(5-CCCTACACGACGCTTCCGATCTG-3)和 805R(5-GACTGGAGTCCTTGGCCACCG ATTC-2023,39(6)277徐红云等:根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用3)扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3-V4 高变区。使用Illumina MiSeq 测序系统(美国加利福尼亚州圣地亚哥 Illuminia)进行序列的末端测序。使用 FLASH、QIIME、Mothur、UPARSE 等软件进行序列合并、质量控制、OTU 注释等。最后参考 T
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 根际溶磷伯克 霍尔 Par pp 马尾松 作用 红云
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。