结核分枝杆菌PPE59蛋白...表达、纯化和生物信息学分析_王楚彤.pdf
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1、第 卷 第 期 年 月长治医学院学报 基础研究 基金项目:安徽省自然科学基金项目(,);蚌埠医学院研究生科研创新计划项目(,)作者单位:蚌埠医学院检验医学院检验医学实验中心(安徽 蚌埠);蚌埠医学院检验医学院免疫学教研室;蚌埠医学院检验医学院临床检验诊断学教研室;蚌埠医学院慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室作者简介:王楚彤,女,硕士,研究方向:微生物与免疫学;通信作者:汪洪涛,男,博士,教授,研究方向:抗感染免疫,:;许涛,男,博士,讲师,研究方向:抗感染免疫,:。结核分枝杆菌 蛋白的表达、纯化和生物信息学分析王楚彤,袁美丽,魏 婧,李敏英,许 涛,汪洪涛,摘 要 目的:构建结核分枝杆菌
2、 原核表达载体,异丙基 半乳糖苷()诱导表达和纯化获得 蛋白;同时对 蛋白进行生物信息学分析,预测其可能结构和功能。方法:以 基因组为模板扩增获得 基因,利用同源重组将其克隆至原核表达载体,后转化至大肠杆菌表达菌株()中,诱导表达,采用 亲和层析柱对 蛋白进行纯化,获得重组 蛋白并进行鉴定。使用、.、等软件对 蛋白的理化性质、磷酸化位点和、细胞表位等进行预测和分析。结果:成功构建 重组载体,经诱导表达和纯化,成功获得 蛋白;生物信息学预测发现,有 个开放阅读框,个磷酸化位点,并含有多个 细胞和 细胞抗原表位。结论:成功构建 表达载体,获得高纯度 蛋白,且被抗 小鼠单抗特异性识别;具有大量的磷酸
3、化位点及丰富的、细胞表位,可作为结核病疫苗的重要候选蛋白之一。关键词 结核分枝杆菌;蛋白;原核表达;生物信息学中图分类号 文献标识码 文章编号(),:,:,(),:,:,;结核病(,)是由结核分枝杆菌(,)感染引起的人畜共患慢性传染性疾病。世界卫生组织 年全球结核病报告中显示,全球新发结核长治医学院学报 年第 卷病患者 万,新增死亡病例 万。更严重的是,对一线、二线的治疗药物产生了严重耐药性,以及艾滋病和结核病合并发生。因此,迫切需要确定关键靶点和开发潜在的治疗方法,以及研发新型结核病疫苗。全基因组测序发现基因组上存在一组富含脯氨酸谷氨酸(,)和脯氨酸脯氨酸 谷氨酸(,)蛋白家族,约占基因组编
4、码区的,共编码 个蛋白。家族蛋白主要通过调节免疫反应来增强的毒力,从而影响免疫介导的病原体清除,通过介导结核分支杆菌外膜的营养物质转运调控细胞凋亡并调节细胞因子的分泌,在结核菌发病机制和免疫逃逸中也发挥关键作用。此外,蛋白还可作为潜在的特异性诊断试剂和抗结核疫苗的成分。随着比较基因组学技术的发展,通过全基因组比对研究发现,在结核分枝杆菌复合群中不同种细菌(如、牛分枝杆菌或)的基因组中存在一些缺失片段,这些缺失片段被称为差异区域(,),也称为 区。其 中,区 全 长.,包 括 共 个蛋白,区基因在大多数牛分枝杆菌和 中缺失。研究发现 能够增加 细胞免疫应答,用于血清学诊断时可以区分接种过疫苗的对
5、照和结核患者,具有作为结核诊断抗原的潜力。和 可能作为转座酶发挥相应的功能。和 具有高度同源性,蛋白由 基因编 码,作 为 区 的 毒 力 蛋 白,在与宿主细胞的相互作用中发挥怎样的功能,目前未见详细报道。本研究通过体外表达和纯化获得 蛋白,同时应用生物信息学技术对 蛋白进行结构和功能等 相 关 信 息 预 测,为 进 一 步 研 究 蛋白生物学功能和致病机制,以及为后续结核病的诊断、治疗和疫苗研发奠定基础。材料与方法.材料.主要菌株和载体来源 质粒为蚌埠医学院慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室保存;标准株 基因组购自上海晶诺生物科技有限公司;大肠埃希菌克隆菌株 和表达菌株()感受态细胞
6、均购自天根生化科技(北京)有限公司。.主要试剂限制性核酸内切酶 和 购自宝日医生物技术(北京)有限公司;琼脂糖凝胶 回收试剂盒和快速质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;同源重组试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;卡那霉素购自上海碧云天生物技术有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物均购自英国 公司;其它试剂均为国产分析纯;引物由派森诺生物科技有限公司合成。.方法.目的基因 的扩增从(:)获 取 标准株 基因序列,根据同源重组克隆技术设计引物,上游引物:(下划线为 ),下游引物:(下划线为 )。以 基因组为模板进行 扩增。扩增体系:,.,基 因 组,.,.,.,.。扩增反应条件:预变性
7、 ,变性 ,退火,延伸 ,共 个循环,终延伸。取 扩增产物加入.琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,并对目的基因回收纯化。.重组质粒 的构建及鉴定利用限制性内切酶 和 对 质粒进行双酶切,使其线性化。利用同源重组克隆技术,将纯化的 产物克隆至线性化的载体 上,重组克隆反应体系如下:双酶切产物.,.,.。,水浴 完成重组反应。取 重组产物转化入大肠埃希菌克隆 感受态细胞中,挑选阳性菌落用 引物进行菌落 鉴定。将 鉴定阳性的菌落扩大培养后进行测序鉴定。.蛋白的诱导表达将测序鉴定正确的重组 质粒转化至大肠埃希菌表达菌株()感受态细胞中,挑取阳性菌落进行菌落 鉴定;将鉴定阳性的菌液接种于第 期王楚彤 等 结核分枝
8、杆菌 蛋白的表达、纯化和生物信息学分析 液体培养基(含卡那霉素 )中,震荡过夜培养;后将培养好的菌液按 比例接种到 液体培养基中(含卡那霉素 ),摇床培养至 值达.时,取 菌液作为诱导前菌液,剩余培养液加入终浓度 诱导表达,取 作为诱导后菌液;剩余菌液进行超声破碎,超声破碎后细菌裂解后的全蛋白 离心,分别取超声破碎后上清和沉淀,进行 电泳鉴定。.蛋白的纯化将超声破碎后细菌裂解后的全蛋白,离心 ,离心后沉淀用新鲜配制的包涵体洗涤液(尿素,.)洗涤 次;然后包涵体溶解液(尿素,.)溶解包涵体,离心;将包涵体缓慢滴加至稀释复性缓冲液中,进行梯度稀释复性;将上述复性后的 蛋白加载到预平衡的含有 亲和层
9、析柱,收集流穿液,然后用含 咪唑洗脱液进行洗脱,考马斯亮蓝染色分析蛋白质纯度。.蛋白 鉴定 取纯化后 蛋白进行 电泳,浓缩胶以 电压电泳 ,分离胶以 电压电泳。恒压电转 ,将 蛋白转移至硝酸纤维素膜(),以 脱脂牛奶室温封闭 ;洗涤 次,加入小鼠来源的 单克隆抗体,水平摇床,过夜孵育;洗涤 次,加入 山羊抗小鼠 抗体,室温孵育;洗涤 次,化学发光试剂盒显影。.蛋白的生物信息学分析通过 的 工具分析 基因的开放阅读框架;采用 软件分析 蛋白的理化性质和亲水性;.和 软件预测磷酸化位点和跨膜区;利用 和 软件预测可能的 细胞与 细胞抗原表位。结果.重组载体的构建及鉴定 以 标准株 基因组为模板进行
10、 扩增,扩增出目的基因,见图 所示,扩增产物大小约为 ,与预期大小一致。以转化后阳性菌落为模板,用 引物对其进行菌落 鉴定,其菌落 产物大小约为(见图)。测序结果显示(见图),插入 基因序列 一致。上述结果证实成功构建重组 质粒。:的 扩增产物(:;:阴性对照;:基因扩增);:菌落 鉴定(:;:阴性对照;:菌液);:测序鉴定图 的 扩增产物及重组 载体的构建与鉴定 .蛋白的表达鉴定 电泳鉴定结果显示,诱导后在约 处均有明显蛋白条带(图 泳道),与预期大小一致,超声破碎后上清和沉淀结果表明,蛋白主要以不可溶的包涵体形式表达(图 泳道)。.蛋白的纯化及鉴定 利用 亲和层析柱法对 蛋白进行纯化,分别
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