穿心莲内酯对糖尿病足大鼠血管生成的影响及机制.pdf
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1、 2128 China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17中国药房 2023年第34卷第17期穿心莲内酯对糖尿病足大鼠血管生成的影响及机制 张丽晓 1,戴守方 2,李蕾 3,王瑞锋 2,杨丽丽 2,邱金霞 2,尹永波 4(1.邢台市人民医院中医内科,河北 邢台 054000;2.邢台市人民医院放射科,河北 邢台054000;3.邢台市人民医院内分泌科,河北 邢台054000;4.邢台市人民医院耳鼻喉科,河北 邢台054000)中图分类号 R965;R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2023)17-2128-06DOI 10.6039/j.issn.1
2、001-0408.2023.17.14摘要 目的 探究穿心莲内酯(Andro)对糖尿病足大鼠血管生成的影响,并基于Hippo-Yes相关蛋白(YAP)信号通路探索其作用机制。方法 采用小剂量链脲佐菌素联合高脂高糖饮食复制2型糖尿病大鼠模型,在其建模成功的基础上,用烫伤法建立糖尿病足大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为 5 组,每组 12 只:Model 组,Andro 低、中、高剂量组(1、10、20 mg/kg)和抑制剂组(20 mg/kg Andro+100 mg/kg的Hippo-YAP信号通路特异性抑制剂维替泊芬)。另外取12只健康大鼠作为Control组。各组大鼠灌胃和腹腔注射溶剂或相
3、应药物,每日1次,连续2周。给药结束后,检测大鼠创面愈合情况、空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)含量;以HE染色法观察大鼠创面组织损伤及毛细血管数;采用流式细胞仪进行大鼠外周血内皮祖细胞(EPCs)计数;采用全自动生化分析仪检测大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量;采用Western blot法检测各组大鼠创面组织中缺氧诱导因子1(HIF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)及Hippo-YAP信号通路相关蛋白的表达情况。结果 与Control组比较,Model组大鼠创面愈合率,毛细血管数,EPCs比例,HDL
4、-C含量,HIF-1、VEGF蛋白表达水平及哺乳动物Ste20样激酶1、大肿瘤抑制基因1、YAP蛋白的磷酸化水平均显著降低,FBG、FINS水平及TC、TG、LDL-C含量均显著升高(P0.05)。与Model组比较,Andro低、中、高剂量组大鼠上述指标均显著逆转,且呈剂量依赖性(P0.05);维替泊芬减弱了Andro的上述逆转作用(P0.05)。结论 Andro具有降低糖尿病足大鼠血糖、血脂,促进糖尿病足大鼠血管生成及创面愈合的作用,其作用机制可能与激活Hippo-YAP信号通路有关。关键词 穿心莲内酯;糖尿病足;血管生成;Hippo-Yes相关蛋白信号通路Effects of andro
5、grapholide on angiogenesis in diabetic foot rats and its mechanismZHANG Lixiao1,DAI Shoufang2,LI Lei3,WANG Ruifeng2,YANG Lili2,QIU Jinxia2,YIN Yongbo4(1.Dept.of Chinese Internal Medicine,Xingtai People s Hospital,Hebei Xingtai 054000,China;2.Dept.of Radiology,Xingtai Peoples Hospital,Hebei Xingtai 0
6、54000,China;3.Dept.of Endocrinology,Xingtai Peoples Hospital,Hebei Xingtai 054000,China;4.Dept.of Otolaryngology,Xingtai People s Hospital,Hebei Xingtai 054000,China)ABSTRACTOBJECTIVE To investigate the effects of andrographolide(Andro)on angiogenesis in rats with diabetic foot and to explore its me
7、chanism of action based on the Hippo-Yes-associated protein(YAP)signaling pathway.METHODS The rat model of type 2 diabetes was established by using low-dose streptozotocin combined with high-fat and high-glucose diet.On the basis of successful modeling,the rat model of diabetes foot was established
8、by scalding.Model rats were randomly divided into 5 groups with 12 rats in each group:model group,Andro low-dose,medium-dose,and high-dose groups(1,10,and 20 mg/kg),as well as inhibitor group(20 mg/kg Andro+100 mg/kg of verteporfin,an specific inhibitor of Hippo-YAP signaling pathway);other 12 healt
9、hy rats were included in the Control group.Rats in each group were intragastrically and intraperitoneally injected with solvents or corresponding drugs,once a day,for 2 consecutive weeks.The wound healing,fasting blood glucose(FBG)and fasting insulin(FINS)were detected in rats after medication.HE st
10、aining was performed to observe the tissue damage and capillary number of rat trauma;the number of endothelial progenitor cells(EPCs)in peripheral blood of rats was counted by using flow cytometry;the contents of serum total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C
11、)and low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C)in rats were determined by fully automatic biochemical analyzer;the expressions of hypoxia-inducible factor 1(HIF-1),vascular endothelial growth factor(VEGF)and Hippo-YAP signaling pathway-related proteins in the traumatic tissues of rats in each group
12、were 基金项目 邢台市科技计划项目(No.2018ZC212)第一作者 副主任中医师,硕士。研究方向:糖尿病及其并发症。电话:0319-3138801。E-mail:中国药房 2023年第34卷第17期China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17 2129 detected by Western blot.RESULTS Compared with Control group,the wound healing rate,capillary number,the proportion of EPCs,HDL-C content,as well as the protei
13、n expression levels of HIF-1 and VEGF and the phosphorylation levels of mammalian Ste20-like kinase 1,large tumor suppressor gene 1 and YAP proteins were significantly reduced in the model group,while the FBG,FINS levels and TC,TG and LDL-C contents were significantly increased(P0.05).Compared with
14、model group,the above indexes were significantly reversed in Andro low-dose,medium-dose and high-dose group,in a dose-dependent manner(P0.05);verteporfin attenuated the above reversal effect of Andro(P0.05).CONCLUSIONS Andro has the effects of lowering blood glucose and blood lipids,promoting blood
15、vessel formation and wound healing in rats with diabetic foot,and its mechanism of action may be related to the activation of Hippo-YAP signaling pathway.KEYWORDSandrographolide;diabetic foot;angiogenesis;Hippo-YAP signaling pathway糖尿病足与糖尿病神经病变、外周血管疾病有关,是1型和2型糖尿病最常见的慢性并发症之一,发病率有逐年增加的趋势;其特征是血管生成受损,如果
16、治疗不当,严重时会导致患者截肢或引发脓毒血症,严重影响了患者的生活质量和生命健康13。促进血管生成及创面愈合是治疗糖尿病足的有效方法之一4。因此,研究糖尿病足的发病机制对于探索新的治疗药物具有重要意义。穿心莲内酯(andrographolide,Andro)具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用5。有研究发现,Andro 可通过降低糖尿病小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、甘油三酯、肾/体重比、血尿素氮、血清肌酐、24 h尿蛋白,抑制氧化应激产物活性氧产生和增加促炎细胞因子,从而改善小鼠的糖尿病肾病6。Liang等7研究发现,Andro通过减轻氧化应激、炎症和细
17、胞凋亡能延缓糖尿病心肌病的进展。Hippo通路及其效应物Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)在调节器官生长、组织修复和再生方面起着重要作用8。Hippo通路的活化使YAP失活,从而抑制细胞存活、增殖和血管生成,该通路和YAP是血管生成和伤口愈合的关键调节因子910,但尚不清楚Andro能否通过调控Hippo-YAP信号通路影响糖尿病足血管生成。因此,本研究主要探究Andro对糖尿病足大鼠血管生成的影响以及其机制,以期为糖尿病足的治疗提供新的参考依据。1材料1.1主要仪器ACCU-CHEK Performa型卓越快速血糖仪购自美国罗氏生物科技公司;3100型全自
18、动生化分析仪购自日本日立有限公司;H1-16K型冷冻高速离心机购自湖南可成仪器设备有限公司;DM500型光学显微镜购自德国Leica仪器有限公司;FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司。1.2主要药品与试剂Andro标准品(纯度98%,货号B20207)、维替泊芬(Hippo-YAP信号通路特异性抑制剂,纯度为97%,货号S80258)均购自上海源叶生物科技有限公司;链脲佐菌素(货号S0130)购自上海宝曼生物科技有限公司;蛋白提取试剂盒(货号YT8951)购自北京伊塔生物科技有限公司;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号G1120-100)购自北京索莱宝科技有限公司;空腹胰岛素(
19、fasting insulin,FINS)ELISA试剂盒(货号FY-A014648)购自上海富雨生物科技有限公司;兔源缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)单 克 隆 抗 体(货 号ab179483)、兔源血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体(货号ab32152)、兔源哺乳动物Ste20样激酶1(mammalian sterile20-like kinase 1,MST1)单克隆抗体(货号 ab245190)、兔源磷酸化MST1(p-MST1)单克隆抗体(货号ab51134)、
20、兔源大肿瘤抑制基因1(large tumor suppressor gene1,LATS1)单克隆抗体(货号ab243656)、兔源磷酸化LATS1(p-LATS1)单克隆抗体(货号ab111334)、兔源磷酸化YAP(p-YAP)单克隆抗体(货号ab76252)、兔源YAP单克隆抗体(货号ab81183)、兔源三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗体(货号ab9485)均购自美国Abcam公司;辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G二抗(货号XY0650)购自上海信裕生物科技有限公司。1.3实验动物SPF级SD
21、大鼠,57周龄,雌雄各半,体重180200 g,购自武汉云克隆动物有限公司,生产许可证编号为SCXK(鄂)2018-0021。设置饲养温度为22,湿度为55%60%,12 h光暗循环适应性喂养1周。2方法2.1动物建模、分组和给药将90只大鼠随机分成Control组(12只)和建模组(78只),各组大鼠雌雄各半。Control组用普通饲料喂养。建模组参考相关文献11,采用小剂量链脲佐菌素联合高脂高糖饮食复制2型糖尿病大鼠模型,高脂高糖饮食喂养4周后,按35 mg/kg一次性腹腔注射0.3%链脲佐菌素(Control组按10 mL/kg注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液),注射后 3、7、10
22、d 取尾静脉血测量大鼠FBG,连续3次测得FBG16.7 mmol/L,则为糖尿病模型造模成功。在此基础上,采用烫伤法建立糖尿病足大 2130 China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17中国药房 2023年第34卷第17期鼠模型12:将糖尿病模型大鼠用普通饲料喂养4周后,按30 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠,用恒温恒压电热烫伤仪在压力为0.5 kg、温度为80、作用时间为4 s的设置下,在大鼠右后肢足背造成烫伤,深至皮下,观察烫伤处皮肤出现苍白、肿胀、破溃等症状;Control组同法进行烫伤处理。将建模成功的大鼠(共 60 只)随机分为Model组,Andro低、中、
23、高剂量组和抑制剂组,每组12只。Andro低、中、高剂量组分别灌胃1、10、20 mg/kg的Andro溶液7和腹腔注射等体积的生理盐水,抑制剂组灌胃20 mg/kg的Andro溶液和腹腔注射100 mg/kg的维替泊芬13,每日1次,连续给药2周;Control组、Model组灌胃和腹腔注射等体积的生理盐水。2.2大鼠创面愈合情况的检测在造模及给药期间对大鼠创面边缘进行测量并拍照,采用Image Pro Plush 6.0图像分析系统对创面面积进行测定,并计算创面愈合率。创面愈合率(%)(原始创面面积未愈合创面面积)/原始创面面积100%。2.3大鼠FBG及FINS含量的测定药物处理结束后,
24、大鼠禁食不禁水12 h,剪尾取血,用卓越快速血糖仪测定大鼠的FBG。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后,腹主动脉取血,离心后得到血清,于20 保存。严格按照FINS ELISA试剂盒说明书测量大鼠的FINS含量。2.4大鼠创面组织损伤及毛细血管数的检测药物处理结束后,腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,分离大鼠创面组织及创面周边肉芽组织,部分创面及创面周边肉芽组织在4%多聚甲醛中过夜固定,经蔗糖梯度脱水、石蜡包埋后切片(3 m)。切片经二甲苯、乙醇脱蜡和水化,以HE染色,然后在显微镜下观察染色结果并拍照,录入MPIAS-400彩色病理图文分析系统,观察毛细血管数。2.5大鼠外周血内皮祖细胞数量的检测
25、药物处理结束后,大鼠腹主动脉取血,用流式细胞仪检测大鼠外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量,具体操作参考文献14。结果以EPCs数量占外周血单核细胞数量的百分比表示。2.6大鼠血清生化指标的检测取“2.3”项下血清,用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol
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