大鼠肠囊外翻法分析核桃肽吸收特性及抗氧化肽筛选鉴定.pdf
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1、李浩铭,李维佳,李佳,等.大鼠肠囊外翻法分析核桃肽吸收特性及抗氧化肽筛选鉴定 J.食品工业科技,2023,44(23):337345.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030031LIHaoming,LIWeijia,LIJia,etal.AnalysisofAbsorptionCharacteristicsofWalnutPeptidesbyEvertedRatSacsandIdentificationofAntioxidantPeptidesJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(23):337345.(in
2、ChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030031 营养与保健 大鼠肠囊外翻法分析核桃肽吸收特性及大鼠肠囊外翻法分析核桃肽吸收特性及抗氧化肽筛选鉴定抗氧化肽筛选鉴定李浩铭,李维佳,李佳,方丽,宋佳淇,吴丹*,闵伟红*(吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春130118)摘要:本研究通过大鼠肠囊外翻法探讨了3kDa 核桃蛋白肽模拟胃肠消化产物的吸收特性,以抗氧化能力(DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、Fe2+螯合率)和活性肽吸收率为指标筛选核桃肽在肠道吸收的最优条件,并应用模拟分子对接技术和 Na
3、no-HPLC-MS/MS 技术对吸收肽组分进行筛选和鉴定,得到能够以完整形式被吸收并发挥抗氧化活性的新型核桃源肽。结果表明:当核桃肽消化产物吸收浓度为 6mg/mL,吸收时间为 2h时,其抗氧化活性最高且在小肠吸收率最高;进一步通过 Nano-HPLC-MS/MS 鉴定结果表明 0.51kDa 活性肽数量最多,其中位于 C 端/N 端氨基酸主要集中在 Pro、Thr、Leu,鉴定出 33 条活性肽能够以完整形式被吸收,穿过肠道屏障;最后通过分子对接技术与 DPP-IV 相结合,获得三条结合能最低的活性肽 NLRFPL、NPDDEFRPQ、KGHLFPN,其结合能分别为8.8、8.6、8.6k
4、al/mol,其中 KGHLFPN 抗氧化能力最强。综上,3kDa 核桃肽模拟胃肠道消化能够释放抗氧化活性更高且能够被小肠吸收的活性肽为 KGHLFPN,本文为探索外源肽小肠吸收特性及筛选鉴定抗氧化肽提供新思路。关键词:核桃肽,肠吸收,抗氧化活性,分子对接本文网刊:中图分类号:TS201.4文献标识码:A文章编号:10020306(2023)23033709DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023030031AnalysisofAbsorptionCharacteristicsofWalnutPeptidesbyEvertedRatSacsandIdentificat
5、ionofAntioxidantPeptidesLIHaoming,LIWeijia,LIJia,FANGLi,SONGJiaqi,WUDan*,MINWeihong*(CollegeofFoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)Abstract:Thisstudyinvestigatedtheabsorptioncharacteristicsof3kDawalnutproteinpeptidessimulatinggastroint-estinaldigestionproductsu
6、singtheevertedratsacsmethod.Theoptimalconditionsforwalnutpeptideabsorptionintheinte-stinewereselectedbasedonantioxidantcapacity(DPPHfreeradicalclearancerate,ABTS+freeradicalclearancerate,Fe2+chelationrate)andactivepeptideabsorptionrate.Theabsorbedpeptidecomponentswerescreenedandidentifiedusingsimula
7、tedmoleculardockingtechnologyandNano-HPLC-MS/MStechnologytoobtainnewwalnutderivedpeptidesthatcouldbefullyabsorbedandhadantioxidantactivity.Theresultsshowedthatwhentheabsorptionconcentrationofwalnutpeptidedigestionproductwas6mg/mL,andtheabsorptiontimewas2h,itsantioxidantactivitywasthehighestandtheabs
8、orptionrateinthesmallintestinewasthehighest.FurtheridentificationbyNano-HPLC-MS/MSshowedthat,the0.51kDaactivepeptidewasthemostnumerous,withtheC-terminal/N-terminalaminoacidsmainlyconcentratedinPro,Thr,andLeu.Thirty-threeactivepeptideswerefullyabsorbedandcrossedtheintestinalbarrier.Bycombiningmolecul
9、ardock-ingtechnologywithDPP-IV,thethreeactivepeptidesNLRFPL,NPDDEFRPQ,andKGHLFPNwiththelowestbinding收稿日期:20230303基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(32101934);吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20220346KJ)。作者简介:李浩铭(1997),男,硕士研究生,研究方向:活性肽消化吸收与营养学评价,E-mail:。*通信作者:吴丹(1989),女,博士,讲师,研究方向:长白山野生资源开发与利用,E-mail:。闵伟红(1971),女,博士,二级教授,研究方向:
10、食源生物活性肽制备与开发研究,E-mail:。第44卷第23期食品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.2023energiesof8.8,8.6,and8.6kal/mol,respectivelywereobtained.Amongthese,KGHLFPNdisplayedthestrongestantioxidantcapacity.Insummary,simulatinggastrointestinaldigestionwith3kDawalnutpeptidescouldreleasetheacti
11、vepeptideKGHLFPN,whichhadthehighestantioxidantactivityandcouldbeabsorbedbythesmallintestine.Thesefindingswouldprovidenewideasforstudiesexploringtheintestinalabsorptioncharacteristicsofexogenouspeptides,andthescre-eningandidentificationofantioxidantpeptides.Keywords:walnutpeptide;intestinalabsorption
12、;antioxidantactivity;moleculardocking生物活性肽是由 220 个不同氨基酸组成、具有组织亲和力高、安全性好且在细胞内发挥较强生理活性的一类物质1。按照来源划分,生物活性肽可分为内源肽和外源肽。内源肽常以酶、激素等形式在机体中发挥生理作用2,但食物中摄取的外源肽不同于内源肽,其需要借助人体消化系统进入体内才能发挥活性功能3。外源肽的利用必须克服胃肠消化酶的分解和穿透小肠上皮细胞形成的肠道屏障4,许多长肽在胃的酸性条件下已被分解成短肽,无法完整进入小肠,而一些短肽已有研究证实其能耐受胃酸的条件,但小肠吸收率低,生物利用度低5。有研究证实小肠壁表面含有许多刷状缘肽
13、酶,多肽必须成功抵抗刷状缘肽酶水解才能被完整吸收,二肽基肽酶(DPP-IV)是在肠道中密集分布且活性最高的刷状缘肽酶67,其是一种可裂解多肽末端二肽的丝氨酸蛋白酶,当多肽残基末端倒数第二氨基酸是脯氨酸、羟基脯氨酸、脱氢脯氨酸或丙氨酸时,DPP-IV 与之结合能力较强8。Suzuki 等9研究发现,涉及甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的肽键不易被大多数胃和胰腺蛋白酶水解。因此,含有脯氨酸、羟基脯氨酸、脱氢脯氨酸或丙氨酸的多肽可通过与 DPP-IV 结合而抵抗肠消化酶水解作用,从而以完整形式吸收。氧化应激是指机体受到不同应激原刺激或病原菌感染时,产生大量自由基,特别是活性氧(reactiveoxygens
14、pecies,ROS)通过氧化还原机制对机体产生的氧化损伤10。氧化应激已被证明是许多常见疾病的发病诱因之一,如高血压11、慢性阻塞性肺病12等。因此,抗氧化剂的挖掘利用对人类健康至关重要。又因天然成分安全性更高,而使天然抗氧化剂的筛选成为抗氧化成分挖掘的新方向。核桃蛋白通过酶解纯化并筛选鉴定后得到特定核桃肽序列13,已有研究证实了某些特定核桃肽具有抗氧化14、改善记忆力15等生理功能。王薇等16通过酶水解法制备核桃蛋白水解物,并通过 ORAC 法和 H2O2诱导的 PC12细胞筛选出 3 条抗氧化肽 QGRPWG、PSRADIY 和AYNIPVNIAR。然而,活性肽完整高效吸收是其发挥活性功
15、能的前提,近几年活性肽的生理功能被不断拓展,但关于活性肽吸收与生理活性的关系及活性肽氨基酸组成与吸收的关系相关研究鲜有报道,探索活性肽的吸收特性及肽吸收与功能活性的关系成为众多学者关注的热点。目前,因体内动物消化吸收模型具有周期长、消耗大等特点,构建体外模拟消化吸收模型已成为研究者关于研究生物活性分子吸收问题的新方法1718,已有许多学者通过建立体外大鼠外翻肠囊模型进行了营养组分评价19,如矿物质20、脂肪酸21、糖醇2223和黄酮物质24的吸收特性及生物利用度已有明确报道。丁龙25利用 Caco-2 细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型研究了蛋清蛋白模拟消化水解物混合肽的吸收情况。因此,本研究通过大
16、鼠肠囊外翻法和抗氧化活性测定研究了核桃肽消化产物的抗氧化活性和其吸收特性明确活性肽在肠道吸收的最优条件,继而利用 Nano-HPLC-MS/MS 和分子对接技术筛选鉴定出与 DPP-IV 稳定结合且能完整高效吸收的抗氧化活性肽,为核桃源高效吸收抗氧化肽开发利用奠定了理论基础。1材料与方法1.1材料与仪器核桃蛋白肽混合物由脱脂核桃粕酶解超滤制得,分子量3kDa(纯度85%,氨基酸15%),由吉林农业大学发酵工程实验室自制26;健康雄性 SpragueDawley(SD)大鼠33 只体质量 200220g,辽宁长生生物技术股份有限公司(生产许可证号:NO.SCXK(辽)2020-0001);5%w
17、/v 水合氯醛上海源叶生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、谷胱甘肽(GSH)美国 Sigma 有限公司;其他试剂均为国产分析纯。FluoroskanAscentFL 荧光酶标仪、串联 EASY-nanoLC1200 的 OrbitrapFusion 质谱仪美国赛默飞世尔科技有限公司;UNIC-7200 紫外分光光度计成都泰盟科技有限公司;AllegraX-22 型台式高速离心机北京东讯天地医疗仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1不同分子量核桃肽抗氧化性的测定1.2.1.1D
18、PPH 自由基清除能力的测定参照 Yang等27的方法,向试管中加入 2mL 核桃肽溶液和2mL60mol/L的 DPPH 溶液(乙醇溶解),混合均匀后避光放置 30min,在 517nm 波长下测吸光值。取同浓度的 GSH 作为阳性对照。清除率计算公式如下:DPPH自由基清除率(%)=A0(A1A2)A0100式中:A0为用蒸馏水代替核桃肽溶液的空白吸光值;A1为核桃肽溶液吸光值;A2为不加 DPPH 溶液的对照吸光值。338食品工业科技2023 年12月1.2.1.2ABTS自由基清除能力的测定参照 Song等28的方法,制备 ABTS+自由基储备液:7mmol/L的 ABTS 水溶液和
19、2.49mmol/L 的过硫酸钾水溶液等体积混合,避光放置 1216h,4 保存。配制ABTS+自由基工作液:加入 5mmol/L 的 PBS 稀释,使溶液在 734nm 波长下吸光度为 0.7000.002。测定时,向 96 孔板每孔加入 10L 核桃肽溶液和 190LABTS+自由基工作液,6min 后于 734nm 波长下测定吸光值。取同浓度的 GSH 作为阳性对照。清除率计算公式如下:ABTS+自由基清除率(%)=A0(A1A2)A0100式中:A0为用蒸馏水代替核桃肽溶液的空白吸光值;A1为核桃肽溶液吸光值;A2为不加 ABTS 溶液的对照吸光值。1.2.1.3Fe2+螯合能力的测定
20、参照 Zhang 等29的方法,在试管中依次加入 0.5mL 核桃肽溶液,1mL20mol/L 的 FeCl2溶液和 1mL0.5mmol/L 菲洛嗪,混匀后 25,水浴 20min 后,于 562nm 波长下测吸光值。取同浓度的 EDTA 作为阳性对照。Fe2+螯合率的计算公式如下:Fe2+螯合率(%)=A0(A1A2)A0100式中:A0为用蒸馏水代替核桃肽溶液的空白吸光值;A1为核桃肽溶液吸光值;A2为不加菲洛嗪的对照吸光值。1.2.2构建大鼠离体肠囊外翻模型本实验严格按照吉林农业大学实验动物中心(实验动物使用许可证:SYXK(吉)2018-0023)的建议进行(伦理审查受理号:2021
21、0311002)。参考 Wei 等30的方法并进行部分修改。将购买的 33 只大鼠随机分成 1 个空白组,5 个浓度组(2、4、6、8、10mg/mL),保持 2h 的孵育时间;5 个时间组(1、1.5、2、2.5、3h),保持 6mg/mL的黏膜侧肽浓度,每组 3 只平行实验,适应性饲养1 周,禁食 15h 后开始实验。抓取大鼠待其状态平稳后腹腔注射 4%水合氯醛(剂量:10L/g,以大鼠体重计算)麻醉,随后通过腹部切口快速取出大鼠小肠(十二指肠、空肠、回肠)并采用断头法处死大鼠,将小肠用预冷生理盐水清洗去除肠内容物后在4,通入 95%O2的缓冲液中将肠囊外翻,浆膜侧加入 1mLKRB-IP
22、A 缓冲液(pH7.4),肠囊两端扎紧,黏膜侧放入不同浓度分子量3kDa 核桃肽肠消化产物中,37 恒温水浴处理相应时间后取出肠囊,收集肠囊浆膜侧溶液。空白组采用等量 KRB-IPA 缓冲液(pH7.4)替代分子量3kDa 核桃肽肠消化产物溶液。1.2.3肽吸收率测定利用紫外可见光光度计在270nm 处测定大鼠离体肠囊外翻法收集的黏膜侧和浆膜侧样品肽浓度,并计算肽吸收率,计算公式如下:吸收率(%)=A1(A1+A2)100式中:A1为浆膜侧肽含量;A2为黏膜侧肽含量。1.2.4核桃肽体外消化产物抗氧化能力测定分别选取小肠的不同部位(十二指肠、空肠、回肠)、肽浓度(2、4、6、8、10mg/mL
23、)和转运时间(1、1.5、2、2.5、3h)作为 3 个变量,测定核桃肽浆膜侧肽溶液抗氧化活性(考察核桃肽浓度对浆膜侧肽溶液抗氧化活性的影响时,以肽浓度为变量,控制转运时间为 2h;考察转运时间对浆膜侧肽溶液抗氧化活性的影响时,以转运时间为变量,控制核桃肽浓度为 6mg/mL)。1.2.5Nano-HPLC-MS/MS 分析收集大鼠肠囊浆膜侧溶液,对其冷冻干燥制成粉末,并采用 C18除盐柱进行除盐后,采用 AcclaimPepMapC18(75m25cm)分析柱;进样量 8L;流量 300nL/min,流动相 A 相:0.1%甲酸水溶液;B 相:含 0.1%甲酸的乙腈溶液,柱温 40,电喷雾电
24、压 2kV。质谱参数设置如下:MS 扫描范围 1001500m/z,分辨率=70000,AGCtarget=3e6,最大注入时间50ms;HCD-MS/MS(top20):分辨率=17500,隔离窗口=2m/z,AGCtarget=1e5,最大注入时间 45ms,碰撞能量为 28ev,动态排除时间=30s。根据 Nano-HPLC-MS/MS 鉴定得到的 denovo表对肽浓度 6mg/mL 吸收 2h 十二指肠部分大鼠肠囊浆膜侧活性肽序列信息进行整理总结,分析可被吸收的肽结构特征。1.2.6分子对接通过 DiscoveryStudio2017R2(Biovia,SanDiego,CA,USA
25、)模拟大鼠外翻肠囊浆膜侧 Nano-HPLC-MS/MS 鉴定后且具有抗氧化特征氨基酸的肽序列与 DPP-IV 的相互作用,并使用CHARMm 力场使其能量最小化。DPP-IV 的晶体结构来源于 PDB 数据库(5T4B),可在 https:/www.rcsb.org 获得。根据结合能得分,评估活性肽与 DPP-IV 结合的稳定性。1.2.7合成肽制备及抗氧化活性测定委托合肥赛曼诺生物科技有限公司完成,采用固相合成技术对 肽 NLRFPL(Asn-Leu-Arg-Phe-Pro-Leu,纯 度98.65%)、KGHLFPN(Lys-Gly-His-Leu-Phe-Pro-Asn,纯度 98.0
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