大鼠脊髓损伤后脱髓鞘病变及pEGFR的表达变化.pdf
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1、论著639脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期11Fusco L,Serino D,Santarone ME.Three different scenarios forepileptic spasmsJ.Epilepsy Behav,2020,113:107531.doi:10.1016/j.yebeh.2020.107531.12 Zhao SY,Wu HP,Yu XY,et al.High-dose prednisone therapyfor infantile spasms and late-onset epileptic spasms in China:theadditi
2、on of topiramate provides no benefitJJ.Seizure,2019,71:174-178.doi:10.1016/j.seizure.2019.07.016.13 Caraballo R,Semprino M,Fasulo L,et al.Status of epileptic spasms:A study of 21 childrenJ.Epilepsy Behav,2022,126:108451.doi:10.1016/j.yebeh.2021.108451.14Takahashi Y,Ota A,Tohyama J,et al.Different ph
3、armacoresistanceof focal epileptic spasms,generalized epileptic spasms,andgeneralized epileptic spasms combined with focal seizuresJ.Epilepsia open,2022,7(1):85-97.doi:10.1002/epi4.12560.15Moosa AN,Velayudam KV,Erdemir G.Electroclinical featuresin epilepsy surgery candidates with epileptic spasmsJ.J
4、 clin neurophysiol,2022,39(7):552-560.doi:10.1097/WNP.0000000000000907.16Xue J,Qian P,Li H,et al.Atonic elements combined or uncombinedwith epileptic spasms in infantile spasmsJJ.Clin Neurophysiol,2017,128(1):220-226.doi:10.1016/j.clinph.2016.11.008.(收稿日期:2 0 2 3-0 1-15)大鼠脊髓损伤后脱髓鞘病变及pECFR的表达变化龚睿李兴琼晏
5、四斤李腊梅杜瑶曾庆盈张敏【摘要】目的探讨大鼠脊髓损伤(SCI)后有髓神经纤维数量、超微结构与活化型表皮生长因子受体(pEGFR)及其下游蛋白少突胶质细胞系转录因子-2(Olig-2)的表达变化之间的关系。方法制备大鼠SCI模型,BBB(Ba s s o Be a t t i e&Br e s n a h a n)评分观察大鼠后肢神经功能;勒克索尔固蓝(LFB染色计数有髓神经纤维的数量;电子显微镜观察有髓神经纤维的超微结构;蛋白印迹(Wb)检测各组pECFR、O l i g-2的表达水平。结果SCI后,大鼠损伤平面以下的神经功能几乎完全丧失,随着时间的延长其神经功能有一定程度的恢复,BBB评分随
6、着时间延长而逐渐升高、有髓神经纤维的数量随着时间的延长亦逐渐增加。电子显微镜显示,SCI后出现如下病理改变:轴突、髓鞘水肿及髓鞘结构紊乱、增厚甚至溃变、崩解;随着时间延长,轴突及髓鞘的肿胀程度较前减轻,髓鞘结构亦逐渐致密。pECFR、O l i g-2 的表达随时间延长而逐渐增加并于14d达到高峰。腹腔注射选择性pECFR抑制剂(PD153035)14d后,pECFR、O l i g-2 的表达,大鼠BBB评分及有髓神经纤维数量均较模型14d组明显降低;抑制剂组的轴索肿胀程度明显加重,轴浆线粒体数量减少,髓鞘分层而呈重度脱髓鞘改变。结论pECFR的表达与大鼠SCI后神经纤维的再髓鞘化有关,其机
7、制可能在于pEGFR参与了Olig-2的上调。【关键词】脊髓损伤;神经功能恢复;活化型表皮生长因子受体;少突胶质细胞系转录因子-2中图分类号:R744文献标识码:A文章编号:10 0 6-351X(2 0 2 3)10-0 6 39-0 6The relationship between demyelinating lesion and expression of pEGFR after spinal cord Injury in ratsGong Rui,Li Xingqiong,Yan Sijin,Li Lamei,Du Yao,Zeng Qingying,Zhang MinDepartm
8、ent of Massage,Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing 402160,ChinaCorresponding author:Zhang Min,Email:基金项目:重庆市永川区科委课题(Ycstc,2 0 16 n c 50 2 3),重庆市教育委员会科学技术研究计划青年项目(KJQN202315112)作者单位:40 2 16 0 重庆,重庆市永川区中医院(龚睿、李兴琼、晏四斤、李腊梅、杜瑶、曾庆盈);重庆医科大学附属永川医院(张敏)通信作者:张敏,Email:640脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期
9、Abstract Objective Investigating the relationship between the neural functions,the amout of myelinatednerve fibers,the ultrastructural changes of myelin sheath and the expression level of phosphorylated epidermal growthfactor receptor(pECFR),Olig-2 after spinal cord injury(SCI)in rats.Methods The SC
10、I model was established.The neural functions were monitored by the Basso,Beatie&Bresnahan(BBB)locomotor rating scale,and the numberof myelinated nerve fibers was detected by Luxol fast blue(LFB)staining.The ultrastructural changes of myelinatednerve fibers were observed by electron microscope,and th
11、e expressions of pEGFR,Olig-2 were detected by westernblotting(Wb).Results The neural functions was completely lost but recovered to some extent with the extension oftime after SCI.The BBB scores and the number of myelinated nerve fibers increased gradually with time after SCI.Electron microscopy sh
12、owed that the axons of spinal cord were swollen in varying degrees;the myelin sheath wasedema,disordered,thickened and finally was degenerated,disintegrated;the swelling degree of myelin decreased andthe structure of myelin sheath became denser gradually with time extension after SCI.The expression
13、of pEGFR,Olig-2increased gradually with time and reached a peak at 14 days after SCI.Compared with the day 14 group,significantlydecreases in expression of pEGFR,Olig-2,BBB scores and number of myelinated nerve fibers were observed in ratswhich were injected intraperitoneally selective pECFR inhibit
14、or(PD153035)for 14 days.In the inhibitor group,the swelling degree of axons was obviously aggravated,the distance between axons was reduced,the mitochondriain axoplasm was decreased,the myelin sheath was stratified,and the myelin sheath was heavily demyelinated.Conclusion The expression of pEGFR is
15、related to the remyelination of nerve fibers and the mechanism may be thatpEGFR is up-regulates the expression of Olig-2 after SCI in rats.Key words1 Spinal Cord injury;Neural function recovery;Phosphorylated epidermal growth factor receptor;Olig-2脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)可导致严重神经功能障碍、脱髓鞘病变是SCI最重要的病
16、理改变之一 1-。资料显示,活化型表皮生长因子受体(phosphorylated epidermal growth factor receptor,pECFR)可以促进中枢神经系统少突胶质细胞(o l i g o d e n d r o c y t e s,O Ls)的增殖和分化、抑制OLs的调亡 4-7 ,提示pEGFR对髓鞘可能有保护作用。本实验在建立大鼠SCI模型的基础上,观察SCI后神经功能、有髓神经纤维数量、髓鞘结构,pEGFR及其下游信号分子少突胶质细胞系转录因子-2(oligodendoocyte lineage transcription factor-2,Olig-2)的表达
17、变化,并分析SCI后有髓神经纤维数量、髓鞘结构及pEGFR、O l i g-2 表达变化之间的关系,初步探讨pEGFR对SCI后大鼠有髓神经纤维数量、髓鞘结构的影响,同时尝试探讨上述影响产生的机制。材料与方法1.实验动物和分组雌性SD(Sp r a g u e D a w l e y)大鼠(12 0 只,2 0 0 g230g,SPF级)被随机分成6 组:正常组(NormalGroup,NO R)2 0 只,假手术组(Sham group,Sh a m)20只,模型1d组(Model1DayGroup,D 1)2 0 只,模型7 d组(Model7DayGroup,D 7)2 0 只,模型14
18、d组(Model14DayGroup,D 14)2 0 只,模型2 1d组(Model21DayGroup,D 2 1)2 0 只和PD153035组(PD 1530 35G r o u p)2 0 只。大鼠均由重庆医科大学实验动物中心提供。2.试剂与仪器兔抗大鼠phosphor-EGFR一抗(Abcam,ab15669,英国),pEGFR抑制剂(Abcam,a b 1418 39,英国);兔抗大鼠Olig-2多克隆抗体(Abcam,ab81093,英国);钱酸(南非);恒冷切片机(LeicaCM1900,德国),电子显微镜竟(Hitachi-7500,日本)。3.动物模型制作参考Liang等
19、 8 方法制作正常组、假手术组、模型组(包括D1,D7,D14,D21),造模成功后取出目标组织进行研究。PD153035组:造模成功后立即腹腔注射0.6 mgkg选择性pEGFR抑制剂(PD153035),以后每2 4h重复注射1次,14d后取出脊髓进行研究。4.Basso Beattie&Bresnahan(BBB)评分独立的两个观察者使用双盲方法,根据Basso,Beattie和Bresnahan(BBB)等级量表对大鼠活动进行评分 9-10 ,后肢全瘫为0 分,正常为2 1分。5.有髓神经纤维计数各组大鼠均取L1段脊髓,依次用4%多聚甲醛固定、30%蔗糖脱水后用恒冷冰切片机连续切片,然
20、后进行LFB染色,最后以10 0 0 倍光学显微镜检测,每张切片随机选取5个视域,图像通过Image图像软件对神经纤维髓鞘数进行分析和计数。6.有髓神经纤维超微结构观察641脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期参考Liang等 8 方法取出1mm脊髓后索组织,依次用4%戊二醛、1%钱酸固定;酒精丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋;切片;枸橡酸铅、醋酸铀染色;使用电子显微镜观察脊髓后索中有髓神经纤维的超微结构。每个标本随机选取4个视域,利用MIAS医学图像分析管理系统计算G-ratio。7.Westernblotting检测pECFR、O l i g-2 蛋白表达变化参考Liang等8 发
21、明方法,取出脊髓组织,然后进行离心、吸取上清液、测定蛋白浓度(BCA法)煮沸变性,再根据蛋白定量结果加样、电泳、转膜、封闭、洗膜、孵育、再次洗膜、加人二抗于室温反应2 h,最后使用ECL法显色。8.统计学方法使用SPSS20.0(IBM,In c.,U SA)统计软件,计量资料以(s)表示。单因素方差分析(one-wayANOVA)检测各组之间差异,之后用LSD进行两两比较;PD153035组与D14组间的差异用独立样本t检验进行分析。以P0.05为差异有统计学意义。结果1.BBB评分(图1)25-20-15-10-5-dbCaeNORShamPD153035注:与NOR组,Sham组相比较,
22、模型组及PD153035组BBB评分明显降低,*P0.05,b P 0.0 5,P 0.0 5,p 0.0 5,P 0.0 5;SCI后,随着时间延长,BBB评分有一定程度恢复,与D1组相比较,P0.05,dP0.05;然而,腹腔注射选择性pEGFR抑制剂后,BBB评分降低,与D14组相比较,“P0.05图1神经功能评分BBB评分显示,与NOR组,Sham组相比较,SCI后大鼠后肢运动功能几乎完全丧失(P0.01,bp0.01,P 0.0 1,d P 0.0 1,P 0.0 1),但随着时间延长其功能有一定程度的改善(D14组vs.D1组,P0.05;D 2 1组vs.D1组,dP0.05);
23、PD 1530 35组大鼠后肢功能虽有一定程度的恢复,但其恢复程度较模型14d组明显降低。(PD153035组us.D14组,P0.05)。2.LFB染色(图2)50um50um50m50umBD图2 A:正常组(NOR)图2 B:假手术组(Sham)图2 C:模型1d组(D1)图2 D:模型7 d组(D7)有髓神经纤维有髓神经纤维有髓神经纤维有髓神经纤维?5000-4000-3000-2000-1000-50um50um50m0102?Gsham图2 E:模型14d组(D14)图2 F:模型2 1d组(D21)图2 F:PD 1530 35组图2 H:SCI 后脊髓有髓有髓神经纤维有髓神经纤
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