PPARα基因敲除诱导小鼠肝脏脂质蓄积的作用研究.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金-新疆联合基金本地青年人才培养专项项目(U 1 9 0 3 3 0 4);新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目(2 0 2 2 D 0 1 D 1 6 9)作者简介:秦可欣(1 9 9 7-),女,在读硕士,研究方向:脂质代谢。通信作者:陈邦党,男,博士,研究员,博士生导师,研究方向:脂质代谢,E-m a i l:c h e n b a n g d a n g 1 2 6.c o m。基础医学研究本文引用:秦可欣,陈小翠,崔元峰,等.P P A R 基因敲除诱导小鼠肝脏脂质蓄积的作用研究J.新疆医科大学学报,2 0 2 3,4 6(1 0):1 2 6 7-1 2 7
2、 2.d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.1 0.0 0 1P P A R 基因敲除诱导小鼠肝脏脂质蓄积的作用研究秦可欣1,陈小翠2,崔元峰1,阿比旦阿卜杜如苏力1,托罗娜依米吉提1,陈邦党1,2(新疆医科大学1基础医学院,2第一附属医院临床医学研究院,乌鲁木齐 8 3 0 0 0 0)摘要:目的 探讨P P A R 基因敲除(P P A R KO)对小鼠肝脏脂质蓄积的影响。方法 普食喂养至4月龄的雄性野生型小鼠(WT组)和P P A R 基因敲除小鼠(P P A R KO组),各8只。称量两组小鼠体重、肝脏湿重。酶法测定肝脏
3、及血清中总胆固醇(T C)及甘油三酯(T G)水平。HE染色观察肝脏组织的病理学变化,油红O染色检测脂滴堆积程度。W e s t e r n B l o t检测P P A R 及其脂肪酸转位酶(C D 3 6)、花生四烯酸羟化酶(C y p 4 a 1 4)以及脂滴包被蛋白2(P l i n 2)的蛋白表达。结果 与WT小鼠相比,P P A R KO小鼠体重、血清和肝脏中T C水平差异无统计学意义(P0.0 5),肝脏湿重、肝脏指数、血清和肝脏中T G水平均显著增加(P0.0 1)。HE染色和油红O染色结果显示,P P A R KO小鼠呈现明显的肝细胞肿胀和肝脏脂质蓄积。W e s t e r
4、 n B l o t结果显示,与WT小鼠比较,P P A R KO小鼠肝脏中C D 3 6和C y p 4 a 1 4的表达均显著降低,P l i n 2的表达显著增高,差异均有统计学意义(P0.0 5),b u t i t h a d s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d l i v e r w e i g h t,l i v e r i n d e x a n d T G l e v e l s i n s e r u m a n d l i v e r(P0.0 1).HE a n d o i l r e d O s t a i n i
5、n g r e v e a l e d e v i d e n t h e p a t o c y t e s w e l l i n g a n d h e p a t i c f a t a c c u m u l a t i o n i n P P A R KO m i c e.T h e w e s t e r n b l o t r e s u l t s s h o w e d t h a t c o m p a r e d w i t h WT g r o u p,t h e e x p r e s s i o n s o f C D 3 6 a n d C y p 4 a 1
6、4 i n l i v e r o f m i c e i n P P A R KO g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y d e-c r e a s e d,w h i l e t h e e x p r e s s i o n o f P l i n 2 w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d,w i t h s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e(P0.0 1).C o n c l u s i o n A f t e r P P
7、 A R k n o c k o u t,t h e e x p r e s s i o n o f C D 3 6 a n d C y p 4 a 1 4 p r o t e i n i s d e c r e a s e d,t h e e x-p r e s s i o n o f P l i n 2 p r o t e i n i s u p-r e g u l a t e d,a n d t h e l i v e r l i p i d a c c u m u l a t i o n i s i n d u c e d,i n d i c a t i n g t h a t P P
8、 A R h a s t h e f u n c t i o n o f i n h i b i t i n g h e p a t i c l i p i d d e p o s i t i o n.K e y w o r d s:P P A R;g e n e k n o c k o u t;l i p i d a c c u m u l a t i o n 非酒精性脂肪肝(N o n a l c o h o l i c f a t t y l i v e r d i s-e a s e,NA F L D)是以肝实质细胞脂肪变性和过量脂质蓄积为主要临床病理学特征的慢性肝病,累及全球2 5%
9、的人口1。1 9 9 9-2 0 1 8年间我国NA F L D发病率由1 8%增加到2 9%,呈逐年上升且年轻化趋势2。NA F L D患者肝脏脂肪酸氧化功能障碍,导致过度异位脂 质沉积和 细胞内 氧 化 还 原 平 衡 改变3,并产生胰岛素抵抗、炎症和氧化应激反应,促使NA F L D进展为脂肪性肝炎(NA S H)、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌4,已逐渐成为肝衰竭和肝移植的重要原因。过氧化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体(P e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r-a c t i v a t e d r e c e p t o r s,
10、P P A R s)是核受体超家族的成员,有三种异构型(、/和亚型)。P P A R 是一种配体激活的转录因子,除肝脏外,其在心脏、骨骼肌、棕色脂肪、肠道和肾脏等多种组织中均有表达,参与诱导脂质代谢途径相关基因表达,下调炎症反应有关信号转导途径相关基因表达5。临床研究发现肝脏中P P A R 基因表达与NA S H严重程度、内脏脂肪 和胰岛素抵 抗呈负相关,且NA S H组织学的改善与其表达增加相关6。在肝脏特异性P P A R 敲除小鼠中,高脂饮食诱导1 2周其肝脏炎症相关指标和血浆总胆固醇水平明显增高7。然而,敲除肠道中P P A R 可限制机体脂质的吸收,并限制脂滴的扩张,抑制肝脏组织中
11、的脂质沉积8。以上结果体现了P P A R 在肝脏脂质代谢稳态和NA F L D进展中的重要地位,但其作用机制较复杂,为了进一步阐明P P A R 在机体脂质代谢中的作用,本研究利用全身性P P A R 基因敲除小鼠模型,研究P P A R 对肝脏脂质蓄积的调节功能,并通过检 测 肝 组 织 中P P A R 所 调 控 的 脂 肪 酸 转 位 酶(C D 3 6)、花生四烯酸羟化酶(C y p 4 a 1 4)以及脂滴包被蛋白2(P l i n 2)的蛋白表达情况,分析其可能的作用机制,为N A F L D等代谢性疾病的防治提供依据。1 材料与方法1.1 实验动物 遗传背景为C 5 7 B
12、L/6 J的雄性野生型 小 鼠(WT组)和P P A R 基 因 敲 除 小 鼠(P P A R KO组),各8只,均购置于上海南方模式生物科技股份有限公司,许可证号码:S C X K(沪)2 0 1 7-0 0 1 0。饲养 于 新 疆 医 科 大 学 动 物 实 验 中 心S P F级屏障系统中,环境温度控制在2 22 5,相对湿度达4 0%7 0%,光暗周期1 2 h,空气洁净度达1万级,自由饮水和进食。严格遵守动物伦理和福利的要求进行所有实验操作,过程均符合标准。1.2 主要试剂及仪器 基因组D N A提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司,货号D P 3 0 4-0 3)。总胆固醇(T
13、 C,日本和光纯药,货号6 3 5-5 0 9 8 1);甘油三酯(T G,日本和光纯药,货号6 3 2-5 0 9 9 1);0.5%油红O(S i g m a公司,批号O 0 6 2 5);H E染液(B i o s h a r p公司,货号B L 7 0 0 B);P P A R 抗体(C a y m a n,货号C a y 1 0 1 7 1 0-1);脂滴包被蛋白2(P l i n 2)抗体(P r o t e i n t e c h公司,货号1 5 2 9 4-1-A P);花生四烯酸羟化酶(C y p 4 a 1 4)抗体(S a n t a C r u z公司,货号S C-2
14、7 1 9 8 3);H s p 9 0(货号a b 1 3 4 9 2)、脂 肪 酸 转 位 酶(C D 3 6)抗 体(货 号a b 2 5 2 9 2 2)、HR P标记的羊抗小鼠(货号a b 6 7 8 9)以及羊抗兔抗体I g G(货号a b 6 7 2 1)均购自A b c a m公司。冰冻切片机、石蜡包埋和切片机(德国L e i c a公司);低温冷冻高速离心机(美国T h e r m o S c i e n t i f i c公司);冷冻研磨仪(浙江美壁仪器有限公司);凝胶成像分析仪C h e m i D o c M、凝胶电泳仪以及P C R扩增仪(美国B i o-R a d公
15、司);琼脂糖凝胶电泳仪(北京市六一仪器厂)。1.3 P P A R 基因敲除小鼠鉴定 小鼠出生至2月龄后,剪取鼠尾约0.5 c m,放置入1.5 m L无菌E P管中,参照天根基因组D NA提取试剂盒操作方法,加入裂解液和蛋白酶K,5 5水浴过夜裂解,9 5变性后,1 2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,取上清为模板行P C R琼脂糖凝胶电泳检测。P C R反应体系(2 0 L/8621 新 疆 医 科 大 学 学 报第4 6卷 管):2T a q P C R M a s t e r M i x I I 1 0 L;引物P 1、P 2各0.5 L;超纯水7 L;D NA模板2 L
16、。引物P 1:C T G G T C T T AAG C T C A C AAT C C T C;引物P 2:C T C T A C A T G G T C A C C T C T G C T C T A。P C R循环条件为:9 5 5 m i n;9 5 1 5 s;5 8 1 5 s;7 2 1 m i n;7 2 5 m i n;4保持,24步循环3 5次,扩增结束的D NA扩增产物经凝胶电泳鉴定,并进行双向测序验证。1.4 血清及肝组织样本收集 小鼠饲养1 6周,两组小鼠禁食不禁水1 2 h后称重,腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠,心脏穿刺采血,血样室温放置1 h后,4冰箱放置2 h,
17、4条件下以3 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,收集血清样本冻存。肝脏经冰盐水漂洗后大体形态拍照,称量肝脏湿重,并将肝脏切成数个小块,液氮快速冷冻后放置-8 0冰箱,部分肝组织制成石蜡切片和冰冻切片备用。肝脏指数的计算公式:肝脏湿重/小鼠空腹体重1 0 0%。1.5 肝脏组织病理学分析 肝脏组织经多聚甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋,5 m厚切片。常规H E染色,在显微镜下观察肝组织病理结构变化。新鲜配置0.3%油红O工作液,3 7 加热1 0 m i n,0.4 5 m滤器过滤待用。从-8 0冰箱中取出包埋的肝脏组织,切成厚度为8 m的冰冻切片,滴加油红O染色孵育5 m i n,
18、充分水洗,水溶性封片剂封片,显微镜下每个切片随机选1 0个视野进行拍照,观察肝组织中脂质蓄积情况。1.6 肝脏及血清中T C和T G含量检测 取2 0 m g左右肝脏组织,加入1.2 m L甲醇/氯仿(1 2体积)混合液匀浆,3 7 3 0 0 r/m i n翻转抽提3 h,2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,收集上清液,加入4 0 0 L蒸馏水震荡混匀,1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,收集有机溶剂层,取2 0 L蒸干后加入等体积无水乙醇溶解脂质,根据试剂盒说明书测定肝脏及血清中甘油三酯和胆固醇的含量。1.7 肝脏组织中P P A R、C D 3 6
19、、C y p 4 a 1 4和P l i n 2蛋白表达 称取2 0 m g肝组织,加入3 0 0 L R I P A裂解工作液并组织匀浆,经超声破碎后提取WT和P P A R KO小鼠的肝组织总蛋白,用B C A蛋白定量分析试剂盒定量后行S D S-P AG E电泳,每孔上样4 0 g总蛋白。以8 0 V恒压电泳3 0 m i n,待样品跑过浓缩胶后,再以1 2 0 V恒压电泳1 h,并以8 0 V恒压3 h转至P V D F膜。经5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,分别与P P A R、C D 3 6、C y p 4 a 1 4和P l i n 2及H s p 9 0一抗(11 0 0 0)4孵
20、育过夜,T B S T洗膜5次,每次5 m i n,后用HR P标记的抗(11 0 0 0)室温孵育2 h,同上洗膜,E C L发光液孵育后,取出P V D F膜于凝胶成像分析仪上进行曝光分析,以H s p 9 0为内参照,I m a g e L a b对目的蛋白与H s p 9 0灰度的比值进行蛋白表达分析。1.8 统计学处理 使用G r a p h P a d P r i s m 8.0统计软件进行 数据分析。实验数 据以均数标准差(x-s)表示。两组均数间比较采用独立样本t检验,P0.0 5,见图2 B。与WT小鼠的肝脏湿 重(0.7 90.0 2)g和 肝 脏 指 数(3.4 00.0
21、 7)%相比,P P A R KO小鼠的肝脏湿重(1.0 40.0 3)g和肝脏指数(4.5 10.0 7)%均显著增加,差异有统计学意义(P均0.0 1),见图2 C、2 D。注:A是肝脏大体形态;B,C,D分别是两组小鼠体重、肝脏湿重及肝脏指数情况;n=8,与WT小鼠比较,*P0.0 1。图2 两组小鼠肝脏形态、体重、肝脏湿重和肝脏指数比较2.3 P P A R 敲除小鼠肝脏组织病理学改变 HE染色结果显示,4月龄P P A R KO小鼠肝细胞出现自发性肿胀,细胞形态不规则,排列结构无序,细胞内存在明显的脂滴空泡,而WT小鼠染色结果正常(图3 A)。油红O染色结果显示,P P A R 基因
22、敲除后胞浆间隙内分布大小不等的脂滴,脂质沉积程度明显增加(图3 B),表明P P A R 基因敲除会增加小鼠肝脏的脂质蓄积。2.4 P P A R 敲除对小鼠肝脏及血清T G和T C水平的影响 与W T小鼠 肝脏T G含量(1 7.4 5 1.7 0)m g/g,血清T G水平(7 0.4 6 3.5 6)m g/d L 相比,P P A R K O小鼠的肝脏T G含量(3 3.2 6 3.0 5)m g/g和血清T G水平(1 2 2.7 1 4.6 1)m g/d L均显著增高,差异有统计学意义(P均0.0 5),见图4 B、4 D。注:A是小鼠肝脏组织HE染色;B是小鼠肝脏组织油红O染色
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