柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能及CARDS TX_NLRP3信号通路的影响.pdf
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1、柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能及 信号通路的影响黄 方,许 诣,杨 雪,汪枝繁,王 静,沈文婷,陈 霞湖北文理学院附属医院(襄阳市中心医院)儿科,湖北 襄阳 收稿日期:基金项目:湖北省自然科学基金项目()作者简介:黄 方(),女,硕士,副主任医师,研究方向为儿科疾病诊疗。:,:通信作者:陈霞(),女,硕士,主治医师,研究方向为儿科疾病诊疗。:,:摘要:目的 探究柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎模型小鼠肺功能以及 信号通路的影响。方法 只小鼠分为对照组,肺炎组,柴葛芩连汤低、高剂量组和阿奇霉素组。鼻腔滴注解脲脲原体菌液进行造模,柴葛芩连汤低、高剂量组灌胃 、柴葛芩连汤;阿奇霉素组灌胃 阿奇霉素溶
2、液 个周期(周期为 ,前 连续灌胃阿奇霉素溶液,后 灌胃等量蒸馏水);对照组和肺炎组灌胃等量蒸馏水,连续 。采用动物肺功能分析仪检测肺功能,法检测肺泡灌洗液中炎症因子水平,染色观察肺组织病理变化,和 法检测肺组织肺炎支原体外毒素()、炎症小体()、凋亡相关斑点样蛋白()、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶()的 和蛋白表达。结果与对照组比较,肺炎组小鼠、降低(),、水平及 、和蛋白表达均升高(),肺泡结构模糊,有炎性细胞浸润;与肺炎组比较,柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠、与 升高(),、水平及 、和蛋白表达均降低(),肺组织病理变化有不同程度缓解。结论柴葛芩连汤可以改善解脲脲原体肺炎小鼠受损的肺功能,
3、该作用可能与抑制 信号通路有关。关键词:柴葛芩连汤;肺炎;解脲脲原体;中图分类号:文献标志码:文章编号:():,(),:,;(,);年 月第 卷 第 期中 成 药 ;(),(),()(),(),(),(),(),:;解脲脲原体也称溶脲脲原体,是原核微生物,属革兰氏阴性菌,常寄生在成年女性生殖道内,通常不具有致病性,但当妊娠女性分娩时,会感染新生儿呼吸道,造成肺炎、肺衰竭甚至导致肺组织发育异常。儿科临床上一般采用静脉注射大环内酯类药物如阿奇霉素、罗红霉素和克拉霉素等进行治疗,但对于 个月以下的患儿,这类药物的安全性和实际药效尚未明确,可能会导致过敏反应,严重的会产生休克,并且该类药物长期使用会导
4、致菌株耐药性增加,降低疗效。柴葛芩连汤出自中医著作 症因脉治,由柴胡、干葛根、黄芩、川黄连等组成,具有清热、消炎、提高免疫力的功效。本研究建立解脲脲原体感染致肺炎的小鼠模型,研究柴葛芩连汤对该模型小鼠肺功能的影响,并对其作用机制进行初步探究,以期为中医临床治疗小儿解脲脲原体肺炎提供实验参考。材料 实验动物 周龄健康 小鼠 只,雌雄不限,体质量(),购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证号(沪),实验动物使用许可证号(鄂)。小鼠于室温下适应性饲养,实验经华中农业大学实验动物伦理委员会批准(编号)。仪器()型动物肺功能分析系统购自北京贝兰博科技有限公司;型定量 仪购自美国 公司;型
5、多功能酶标仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司;型生物光学显微镜购自苏州阿尔法生物实验器材有限公司;型高速冷冻离心机购自北京时代北利离心机有限公司;型电子天平购自德国赛多利斯公司。试剂与药物 柴胡、干葛根、黄芩、川黄连、金银花购自襄阳市中心医院门诊药房,经襄阳市中心医院夏宁副主任药师鉴定为正品。阿奇霉素(国药准字,批号)购自辉瑞制药有限公司。解脲脲原体标准株(效价 )由中国科学院皮肤研究所提供。、酶联免疫吸附()试剂盒(批号、)购自武汉菲恩生物科技有限公司;极速 提取试剂盒(批号)购自哈尔滨新海基因检测有限公司;反转录试剂盒与 ()扩 增 试 剂 盒(批 号)购自北京启衡星生物科技有限公司;全蛋
6、白提取试剂盒(批号)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;兔抗小鼠 、单克隆抗体,辣根过氧化物酶()标记山羊抗兔二抗(批号、)购自英国 公司。方法 分组与造模 只小鼠随即分为对照组,肺炎组,柴葛芩连汤低、高剂量组和阿奇霉素组,每组 只,除对照组外,其余组小鼠均建立解脲脲原体肺炎模型。小鼠腹腔注射 戊巴比妥钠进行麻醉,向鼻孔中滴注 解脲脲原体菌液(),停留 待菌液随小鼠呼吸流入气管;对照组小鼠则滴加等体积生理盐水,每天 次,连续 。药物制备称取柴胡 、干葛根 、黄芩 、川黄连 、金银花 ,冷水没过药材浸 年 月第 卷 第 期中 成 药 泡 ,煎煮 次,每次 ,过滤,合并 次滤液,浓缩至 ,即生药
7、量 ,药液于 冰箱中保存备用。给药建模成功后,柴葛芩连汤低、高剂量组小鼠灌胃给予 、柴葛芩连汤药液,阿奇霉素组灌胃给予 阿奇霉素溶液 个周期(周期为 ,前 连续灌胃阿奇霉素溶液,后 灌胃等量蒸馏水);对照组和肺炎组灌胃等量蒸馏水,连续 。肺功能检测末次给药后 ,将小鼠放置于肺功能分析系统配套的锚箱中,给予异氟烷吸入麻醉,酒精消毒颈部,切开皮肤将气管分离,在气管上做“”字形切口后插管,连接呼吸机,辅助机械通气(呼吸频率 次,呼吸比例 ,潮气量 ),采集用力最大呼气流速()、用力呼气量()、呼气为 肺容积时的流速()。炎症因子水平检测肺功能检测结束后,每组随机选取 只小鼠,处死后剪开胸腔,结扎右侧
8、支气管,左侧气管中注入 生理盐水,轻轻按压左侧肺组织后抽出灌洗液,共灌洗 次,离心后取上清液,按照相应 试剂盒说明书检测肺泡灌洗液中、水平。染色观察肺组织病理学变化取右侧肺组织于 多聚甲醛溶液中固定 ,常规石蜡包埋,制成 厚的石蜡切片,常规苏木精伊红()染色后中性树脂封片,在光学显微镜下观察肺组织的病理变化。法检测肺组织 、表达每组剩余 只小鼠从锚箱中取出后也立即处死,打开胸腔分离肺组织,将左右两侧肺组织分别分装保存在 超低温冰箱中。取小鼠左侧肺组织,使用极速 提取试剂盒提取总,按照反转录试剂盒与扩增试剂盒说明书操作,进行 反应,以 为内参基因,以 法计算 、相对表达,引物序列见表。法 检 测
9、 肺 组 织 、蛋白表达取小鼠右侧肺脏组织,剪成小块,加入 (含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解液)进行匀浆,离心后取上清液,即得总蛋白,法检测总蛋白浓度,加入 后进行 凝胶电泳,依次进行转膜、洗膜、封闭,加入一抗孵育过 表 引物序列 基因引物序列 正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 夜,洗膜后加入二抗孵育 ,滴加 发光液,在凝胶成像仪中曝光目的蛋白条带,分析各条带灰度值,以 为内参,计算目的蛋白的相对表达量。统计学分析 通过 软件进行处理,符合正态分布的计量资料以()表示,两两间比较采用 检验,组间比较采用单因素方差分析。为差异有统计学意义。结果 柴葛芩连汤对解脲脲原
10、体肺炎小鼠肺功能的影响 与对照组比较,肺炎组小鼠、降低();与肺炎组比较,柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠、增加(),其中柴葛芩连汤高剂量作用优于低剂量(),见表。表 柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能的影响(,)(,)组别()()对照组 肺炎组 柴葛芩连汤低剂量组 柴葛芩连汤高剂量组 阿奇霉素组 注:与对照组比较,;与肺炎组比较,;与柴葛芩连汤低剂量组比较,。柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺泡灌洗液中、水平的影响 与对照组比较,肺炎组小鼠灌洗液中、水平升高();与肺炎组比较,柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠灌洗液中、水平降低(),其中柴葛芩连汤高剂量作用优于低剂 年 月第 卷 第 期中
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