苯甲酸在全价饲料中的抑菌效果评价.pdf
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1、问题探讨2023年第44卷第22期 总第691期苯 甲 酸 在 全 价 饲 料 中 的 抑 菌 效 果 评 价 任蒙蒙 董 伟 湛梦颖 汪仕奎 邢丽维*(帝斯曼(中国)动物营养研发有限公司,河北霸州 065799)摘 要:研究使用一种新的简便、快速、灵敏的方法来评价苯甲酸在全价饲料环境中抑菌效果。试验将不同类型全价饲料(保育料、鸡全价料、教槽料)按照110与水混合,在灭菌后接种大肠杆菌K88+进行培养,在不同时间点取10、20 L和30 L(浓度分别为0、0.03%、0.30%)添加到培养皿形成多点矩阵,培养24 h后观察菌斑的形态。并通过保育料比较不同浓度的苯甲酸(0、0.08%、0.10%
2、)和青霉素钠(0.002 5%、0.003 0%、0.003 5%)处理组菌斑形态,考察该方法的灵敏性。结果表明:苯甲酸添加量为0.03%时,在教槽料中的体外抑菌效果优于保育料与鸡全价料;在保育料中添加0.08%苯甲酸,对大肠杆菌K88+有抑菌作用,抑菌效果与添加量成正比;当苯甲酸和青霉素钠浓度分别变化0.02%和0.000 5%时,抑菌效果有明显差异,说明本方法较灵敏。综上所述,全价饲料作为细菌培养基影响了苯甲酸对大肠杆菌K88+体外抑菌效果;本研究所用方法较灵敏,可评估不同类型抑菌剂在不同类型饲料中的最适添加量,从而为畜牧业提供了切合实际生产的依据。关键词:苯甲酸;全价饲料;抑菌方法;大肠
3、杆菌;青霉素钠;抑菌剂doi:10.13302/ki.fi.2023.22.015中图分类号:S816.17 文献标识码:A 文章编号:1001-991X(2023)22-0094-05Evaluation of Bacteriostatic Performance of Benzoic Acid in Complete FeedREN Mengmeng DONG Wei ZHAN Mengying WANG Shikui XING Liwei*(DSM(China)Animal Nutrition Research Center,Hebei Bazhou 065799,China)Abstr
4、act:This study aimed to evaluate the bacteriostatic performance of benzoic acid in a complete feed environment using a new simple and sensitive method.In the experiment,different types of complete feed(pig nursery feed,chicken complete feed,and creep feed)were mixed with water according to 110,inocu
5、lated with E.coli K88+after sterilization,and 10 L,20 L and 30 L(concentrations of 0,0.03%,and 0.30%,respectively)were added to the Petri dish to form a multi-point matrix at different time points,and the morphology of the plaque was observed after 24 h of incubation.Benzoic acid(0,0.08%,0.10%)and p
6、enicillin sodium(0.002 5%,0.003 0%,0.003 5%)were included in the pig nursery feed culture medium to evaluate the sensitivity of this method.The in vitro bacteriostatic effect in the creep feed was better than that of pig nursery feed and chicken feed When the amount of benzoic acid was 0.03%.The add
7、ition of 0.08%benzoic acid to the pig nursery feed has an antibacterial effect on E.coli K88+,and the antibacterial effect is proportional to the amount added.When the concentrations of benzoic acid and penicillin sodium changed by 0.02%and 0.000 5%,respectively,there was a significant difference in
8、 the number of colonies,indicating that the method was more sensitive.In summary,complete feed as bacterial culture medium may comprise or enhance the bacteriostatic effect of benzoic acid on E.coli K88+in vitro.The method used in this study is more sensitive,which can evaluate the optimal amount of
9、 different types of bacteriostatic agents in different types of feed,so as to provide a useful tool for feed industry and animal husbandry.Key words:benzoic acid;complete feed;bacteriostatic methods;E.coli K88+;penicillin sodium;bacteriostatic agents在现代畜牧业中,抗生素因安全问题已经被限制作为饲料添加剂使用,抗生素替代物成为动物营养研究的重点。市
10、场上具有抑菌效果的产品种类繁多,作作者简介:任蒙蒙,硕士,研究方向为动物肠道健康。*通讯作者:邢丽维,硕士。收稿日期:2023-07-1894SILIAO GONGYE2023年第44卷第22期 总第691期用机理和化学特性各不相同,如何科学有效地评估相关产品的实际效果给行业带来困扰1-2。目前,评估体外抑菌方法主要扩散法(琼脂平板扩散法和 E-test法)、梯度稀释法(微量、大量肉汤稀释和琼脂稀释)、时间杀伤试验、薄层色谱生物自显影法、生物发光和流式细胞荧光法等3。首先,这些方法中所涉及的培养基均为标准培养基,而抑菌产品在饲料中的实际效果会受到多种因素的影响,比如饲料成分、pH。因此,基于标
11、准培养基的评估方法无法准确模拟实际生产效果。其次,这些经典方法也具有各自的局限性。比如扩散法的抑菌原理是渗透扩散产生浓度梯度,适用于易溶于水的抑菌物质的测定,对于水溶性低的植物精油,可用二甲基亚砜进行助溶4-5,然而以二甲基亚砜为溶剂时,还需要注意其本身的抗菌作用6,而且添加助溶剂与实际使用场景有一定差别。琼脂稀释法操作繁琐,不适合实验室的常规开展,只能作为回顾性监测7。再次,因成本限制一般企业不具有使用薄层色谱生物显影和流式细胞荧光法评估抑菌剂性能的能力。由此可见,基于自身饲料配方组成、抑菌剂的特性、设备情况和操作的便利性等因素综合考虑开发出的评估方法,才能满足大多数全价饲料企业的现实需求。
12、作为一种安全有效的抗生素类添加剂,苯甲酸在畜禽生产中得到广泛的应用8。然而,苯甲酸微溶于水,不能使用基于扩散的牛津杯法等来评估其抑菌特性。类似于苯甲酸,低溶解度抑菌物质还有很多,比如姜黄素、大蒜素、白藜芦醇等9-11。本试验以苯甲酸为主要研究对象,研究一种基于全价饲料、具有直观、高灵敏、操作简洁的评估方法,以促进抑菌剂的科学合理使用,合理配置资源,降低饲料成本。1 材料与方法1.1 试剂与仪器氯化钠购于国药集团化学试剂有限公司;苯甲酸(含量98%)购于Sigma;青霉素钠(160万单位)购于商丘市成达动物药品厂;胰蛋白大豆肉汤(TSB)培养基、溶菌肉汤(LB)琼脂培养基均购于北京陆桥技术股份有
13、限公司;保育料、鸡全价料、乳猪教槽料均由帝斯曼(中国)动物营养研发有限公司生产(不含有抗生素和苯甲酸);大肠杆菌K88+(CVCC198)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。ZQWY-200 卧式全温振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司);GI54DWS高压蒸汽灭菌锅致微(厦门)仪器有限公司、GHP-9160隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、BSC-1300 A2生物安全柜(苏净安泰)、Mf3菌落统计/显微细胞仪(杭州迅数科技有限公司)、OLS200振荡水浴锅(格兰特)、MS3002S型电子天平梅特勒托利多科技(中国)有限公司、紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司。1.2 制备
14、饲料培养基将饲料粉碎后,过0.25 mm筛,取10 g加入90 mL超纯水10倍稀释饲料,再添加不同类型抑菌剂(可耐高温),充分混匀,然后进行高压蒸汽灭菌(115、20 min),当添加不耐高温的抑菌剂时,如抗生素,要在饲料稀释液灭菌后冷却至50 以下时再添加,制备饲料培养基。1.3 菌液制备及接种将大肠杆菌 K88+单菌落用胰蛋白大豆肉汤(TSB)液体培养基37 培养3 h左右,取2 mL加到比色皿中测定 OD值,OD600为0.51.0时,取100 L菌液加入到饲料培养基中,接种后,饲料培养基中大肠杆菌的含量约为105 CFU/mL。1.4 不同时间点取样及培养如图1所示,分别于接种前、接
15、种后0 h和16 h取样。取100 L饲料培养基,加入到900 L生理盐水中,混匀备用。每一个处理组,分别取 10、20 L 和30 L 混悬液滴加到LB 琼脂培养基中。37恒温培养1824 h,用菌落计数仪进行观察并拍照。根据LB培养基上液滴处菌落生长状况评估抑菌剂的抑菌效果,与不含抑菌剂的对照组相比,菌落数减少即有抑菌作用,菌落数越少抑菌作用越强。1.5 不同类型饲料培养基组成在保育料、鸡全价料、教槽料饲料稀释液中分别添加0、0.03%、0.30%的苯甲酸(具体组成见表1),接种大肠杆菌培养后,观察大肠杆菌在不同类型饲料培养基中的生长差别。1.6 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果对比
16、在保育料培养基中添加不同浓度的苯甲酸或青霉素钠(具体组成见表2),接种大肠杆菌培养后,通过与无抑菌剂空白组对比,观察不同浓度的抑菌剂的抑菌效果。2 结果与讨论2.1 方法的优势如图1所示,本试验检测周期为3d,操作步骤简单,不需要大型仪器,成本较低。本方法将培养皿分为三个区域,每一个区域内为一个处理组,在每个区域内滴入含不同体积(10、20 L和 30 L)稀释液,形成小、中和大三个圆点,如图2所示,从而可以在同一培养皿上观察不同抑菌剂的生长情况。使用菌落法考察不同苯甲酸抑菌能力的大小时,将培养好的抑菌后菌悬液进行不同浓度梯度的稀释,每一个稀释度需要多个独立的培养皿作为平行12。相比而言,本方
17、法减少了稀释梯度,节省了培养皿的95问题探讨2023年第44卷第22期 总第691期使用量,减少涂布和计数时间,本方法可批量操作。使用肉汤稀释法时,加入抑菌剂培养24 h后,观察试管或96孔板底部,浑浊带有沉淀说明有细菌生长,澄清透明说明相应药物浓度有抑菌作用13-14。陈聪15和张昊雪4分别通过指示剂刃天青和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)颜色的变化来表示细菌的生长,但是均无法直接对比澄清透明或无颜色变化的管(孔)之间细菌含量差异。如图3所示,本方法中处理组B2、C2、E2和F2在接种后培养16 h均比初始接种时的菌落数减少,说明在此浓度下均有抑菌作用,同时可根据菌落数的多少对比不同抑
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