LncRNA-MIAT靶向miR-214-3p调控RA-FLS细胞生物学功能机制研究.pdf
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1、Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jul 34渊14冤LncRNA-MIAT 靶向 miR-214-3p 调控 RA-FLS 细胞生物学功能机制研究易金萍1袁黄自坤2袁罗清2袁余瑾2袁邹海虹2袁蔡庆2袁秦奇伟2袁郑悦3袁谭吉3渊1.南昌大学第一附属医院/赣江新区人民医院检验科曰2.南昌大学第一附属医院检验科曰3.南昌大学公共卫生学院袁江西 南昌 330000冤摘要院目的研究 LncRNA-心肌梗死相关转录本渊MIAT冤靶向 miR-214-3p 调控 RA-FLS 细胞生物学功能机制遥 方法选取我院 2021 年 1 月至 2022 年 12 月收治的 60 例类风湿关节炎
2、渊RA冤患者袁所有受试者均拟行膝关节手术治疗袁体外培养 RA-FLS 细胞袁分别提取各患者的样本细胞袁均分成 3 组袁分别为 MIAT 过表达组尧shRNA 沉默组和对照组各 60 例遥 构建 MIAT 过表达尧shRNA 沉默及对照慢病毒载体袁包装慢病毒袁分别转染 RA-FLS 细胞袁检测 RA-FLS 细胞增殖尧凋亡尧侵袭尧迁移及细胞因子分泌的影响遥 结果MIAT 过表达组 LncRNA-MIAT 高于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncRNA-MIAT 低于对照组曰MIAT 过表达组 miR-214-3p 表达低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默
3、组 LncRNA-MIAT 高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥MIAT 过表达组 RA-FLS 细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数高于对照组曰MIAT 过表达组细胞凋亡率高于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞凋亡率低于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 MIAT 过表达组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均低于 shRNA 沉默组尧对照组袁且 shRNA 沉默组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥
4、结论 LncRNA-MIAT 靶向结合 miR-214-3p袁进而调控 RA-FLS 细胞的增殖尧迁移以及侵袭遥关键词院类风湿关节炎曰心肌梗死相关转录本曰miR-214-3p曰生物学功能中图分类号院R446.6文献标志码院B文章编号院1001轧8174渊2023冤14轧2142轧02心肌梗死相关转录本渊Myocardial infarction-as鄄sociated transcription袁MIAT冤是一种在 2006 年首次发现的保守的哺乳动物 lncRNAs袁在细胞核内表达的一个 lncRNA袁其位于人类染色体 22q12.1袁长度为30051bp袁它可与蛋白 NONO 相互作用袁促
5、进了核内旁斑的形成咱1-3暂遥 MIAT 的具体功能尚未完全清楚袁但已有报道 MIAT 参与多种疾病的病理生理过程袁然而关于其在 RA 中的具体作用机制尚未彻底阐明遥鉴于此袁本文通过研究 LncRNA-MIAT靶向 miR-214-3p 调控 RA-FLS 细胞生物学功能机制遥 报道如下遥1资料与方法1.1一般资料选取我院风湿免疫科 2021 年 1 月至 2022年 12月收治的 60例 RA 患者遥 其中男 37例尧女 23 例曰年龄 34耀78渊50.94依5.28冤岁曰体质指数 18耀32渊23.51依2.05冤kg/m2曰接受文化教育年限 5耀16渊9.41依1.29冤年遥 入组人员
6、均已签同意书袁本研究经我院医学伦理委员会审核批准遥1.2纳入与排除标准渊1冤所有受试者均经病理检查确诊为 RA遥 渊2冤均拟行外科手术治疗遥 渊3冤年龄逸18 岁遥 渊4冤入组前并未接受任何相关治疗遥 排除标准院渊1冤合并恶性肿瘤者遥 渊2冤肝尧肾尧肺等脏器功能严重异常者遥 渊3冤神志异常者遥1.3研究方法1.3.1标本的收集和人滑膜成纤维细胞的制备采集 RA 患者的膝/髋关节滑膜组织袁迅速移至实验室超净台袁无菌条件下剔除脂肪组织袁分离和体外培养人RA-FLS 细胞遥 将滑膜组织剪碎成 1耀2 mm3袁加入浓度为10 mg/mL 的域型胶原酶袁于 37益 5%CO2培养箱中孵育消化 4 h袁2
7、00 目筛网过滤后离心收集细胞遥将细胞维持在 10%胎牛血清渊FBS冤的 DMEM 培养基袁于 37益 5%CO2培养箱中培养遥 使细胞贴壁遥 待细胞成长到 85%袁以 25%胰蛋白酶消化细胞遥细胞进行传代渊1颐2冤袁传代到第三代到第五代之间时备用袁分别提取各患者的样本细胞袁均分成 3 组袁分别为 MIAT 过表达组渊60例冤尧shRNA 沉默组渊60例冤尧对照组渊60例冤遥1.3.2MIAT-shRNA 载体的构建并将验证干扰效果最好的 MIAT 的 siRNA 序列作为后续研究干扰序列袁以 pSico 质粒为载体构建 MIAT-shRNA 载体遥 此质粒转染后能够在细胞中干扰 MIAT 表
8、达遥1.3.3MIAT 过表达载体构建将 MIAT 全长序列克隆构建到质粒载体 lncRNA 表达载体 pLCDH-L 上袁鉴定成功后将其命名为 pLCDH-L-MIAT袁此质粒转染后能够在细胞中高表达 MIAT遥1.3.4慢病毒包装常规培养 293T细胞袁取目的质粒尧包装质粒及包装质粒进行共转染袁包装病毒遥 设置框架质粒慢病毒对照遥浓缩后的病毒液分装后冻存于-80益备用遥 慢病毒滴度采用逐孔稀释滴度测定法进行遥 采用包装成功的慢病毒感染 RA-FLS 细胞袁验2142窑窑Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jul 34渊14冤2.3各组细胞因子表达水平比较MIAT 过表达组
9、IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均低于 shRNA 沉默组尧对照组袁且 shRNA 沉默组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 见表 3遥3讨论在前期研究中袁通过生物信息学预测袁发现 MI鄄AT 序列中存在与部分 miRNA 分子互补结合的MREs遥 RT-qPCR 分析 RA 患者滑膜组织中 MIAT 以及潜在 miRNA 之间表达的相关性袁结果显示袁MIAT高表达袁而 miR-214-3p 低表达袁且两者表达呈负相关袁提示 miR-214-3p 可能是 MIAT 调控的靶标遥 已有的报道指出袁miR-214-3p 在多种肿瘤
10、中表达下调袁过表达 miR-214-3p 可显著抑制肿瘤发生发展咱4暂遥目前袁尚未见有关 miR-214-3p 在 RA-FLS 细胞中的功能研究报道遥本文结果显示袁MIAT 过表达组 LncRNA-MIAT高于shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncR鄄NA-MIAT 低于对照组渊P约0.05冤曰MIAT 过表达组 miR-214-3p 表达低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA组别nLncRNA-MIATmiR-214-3pMIAT 过表达组shRNA 沉默组对照组FP6060605.34依0.681.40依0.213.66依0.5819.4820.0000.9
11、4依0.173.09依0.422.14依0.2514.1950.000表 1各组 LncRNA-MIAT尧miR-214-3p 表达情况比较渊x依s冤组别n细胞增殖率渊%冤细胞凋亡率渊%冤迁移细胞数渊个冤侵袭细胞数渊个冤MIAT 过表达组shRNA 沉默组对照组FP60606042.33依8.6088.47依15.9277.62依12.5812.7840.00035.62依3.2710.48依1.7416.24依2.3111.6720.000162.55依20.94468.17依52.79356.28依45.399.4870.00062.62依10.36246.71依31.48181.50依2
12、3.4210.5230.000表 2各组 RA-FLS 细胞增殖尧凋亡尧侵袭尧迁移情况比较渊x依s冤证其过表达或沉默 MIAT 效果遥1.3.5RA-FLS 细胞增殖检测RA-FLS 细胞接种于培养板袁将 MIAT 过表达尧沉默及对照慢病毒转染 RA-FLS 细胞袁转染不同时间点采用 CCK-8 法检测 RA-FLS 细胞增殖活性的变化遥1.3.6RA-FLS 细胞凋亡检测RA-FLS 细胞接种于培养板袁将 MIAT 过表达尧沉默及对照慢病毒转染RA-FLS 细胞袁转染不同时间点采用 AnnexinV/7-AAD 凋亡试剂盒上流式细胞仪检测 RA-FLS 细胞凋亡情况遥1.3.7侵袭与迁移试验
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