L-白雀木醇通过激活Wnt_β-catenin信号通路促进骨折愈合.pdf
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1、基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目()作者简介:白立曦,男,生,硕士,住院医师,:收稿日期:白雀木醇通过激活 信号通路促进骨折愈合白立曦,许静,段鹏,谢万科,徐之超,杜俊凯(西安交通大学第一附属医院急诊中心,西安 ;通讯作者,:)摘要:目的考察 白雀木醇(,)对骨折愈合的促进作用及其对 信号通路的影响。方法将 只大鼠随机分为对照组()和白雀木醇组 ,()白雀木醇,每组 只,给药 周后对大鼠进行安全性评价。构建胫骨骨折大鼠模型,然后将 只胫骨骨折模型大鼠随机分为 组:模型组()、()白雀木醇组(组)和 ()白雀木醇组(组),每组 只。给药 周后,对各组大鼠进行 线检查和 分析及骨痂组织番红
2、 固绿染色。通过 或 检测骨痂组织中骨钙素()、骨桥蛋白()、相关转录因子 ()、碱性磷酸酶()、骨形态发生蛋白 ()、和糖原合成酶激酶 ()的表达。结果对照组和 组大鼠的外观和行为、体质量和摄食量、血液学指标、血清生化指标、脏器系数无显著差异()。与模型组相比,组和 组大鼠的骨痂内新生骨小梁和成骨分化明显增多,伴随骨痂跨越骨折端和编织骨替代软骨细胞。与模型组相比,组和 组大鼠骨痂组织中 、和 的 相对表达水平均升高()。与模型组相比,组和 组大鼠骨痂组织中 、和 的 和蛋白相对表达水平均升高(),的 和蛋白相对表达水平均降低()。结论 白雀木醇可促进胫骨骨折大鼠骨折愈合,其机制可能与 信号通
3、路的激活有关。关键词:白雀木醇;骨折;愈合;成骨分化;信号通路中图分类号:文献标志码:文章编号:():,(,;,:):()()(),:(),()()()(),(),(),(),(),(),(),(),(),(),(),:;山西医科大学学报,年 月,第 卷 第 期骨折是临床中最常见的创伤之一,虽然手术治疗后大多数骨折患者都能正常愈合,然而,仍有 的患者会出现骨折不愈合或延迟愈合的现象 。如何有效加速骨折愈合是骨科重点研究领域,服用促进骨折愈合的药物具有重要作用。白雀木醇(,)是一种存在于多种植物中具有光学活性的肌醇甲氧基类似物。白雀木醇具有多种生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗癌等活性 。
4、其异构体 松醇对破骨细胞生成具有抑制活性,但对成骨细胞生成没有任何影响 。最近有学者报道,白雀木醇促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 的增殖、分化和矿化 。然而,尚不清楚 白雀木醇在体内是否可促进骨折愈合。骨折愈合过程中的骨再生类似于胚胎发生过程,参与这一过程的有骨膜骨化和软骨内骨化两个方面,后者的作用更为重要 。在软骨内骨化过程中,损伤组织周围的间充质细胞分化为软骨细胞,形成软骨桥,然后被编织骨再生替代并最终转变为板层骨 。多种生长因子和信号通路参与骨折愈合过程,其中,信号通路扮演重要角色,参与骨折愈合中软骨细胞的增殖和分化、软骨内骨化、骨痂改建等各个阶段的调节。信号通路的激活通过上调 相关转录因
5、子 (,)的表达促进成骨分化 。信号通路的抑制会延迟软骨内骨化和骨折愈合 。本研究通过观察 白雀木醇对胫骨骨折大鼠模型的治疗作用及其对 信号通路的影响,旨在探讨白雀木醇治疗骨折愈合的作用和机制,为骨折的临床治疗提供候选天然药物。材料与方法 实验材料白雀木醇()购自美国 。二甲基亚砜(,)购自北京凯诗源生物科技有限公司。番红 固绿染色试剂盒()购自北京索莱宝科技有限公司。()、裂解缓冲液()、蛋白浓度测定试剂盒()、超敏 化学发光试剂盒()购自碧云天生物技术研究所 ()购自瑞士 。()购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。()、()、()、()和 ()、标记的二抗()购自英国 。实验仪器 血细胞分
6、析仪购自法国 公司。全自动生化分析仪购自日本日立公司。系统购自瑞士 公司。实时荧光定量 仪购自美国 公司。实验动物 级 ()雄性大鼠(周,)和雌性大鼠(周,)购自西安交通大学实验动物中心,生产许可证:(陕)。大鼠饲养于、相对湿度的环境中,光照调节设置为 光照 黑暗交替,大鼠自由饮水和进食。本研究已获得西安交通大学第一附属医院动物医学伦理审查委员会批准(批件号:动伦审科字第()号)。白雀木醇安全性评价大鼠预适应饲养 周后,将 只大鼠随机分为对照组和白雀木醇组(组),每组 只,雌雄各半。对照组大鼠腹腔注射 的 二甲基亚砜(),组大鼠腹腔注射 剂量为 ()的 白雀木醇,共给药 周。给药期间观察大鼠外
7、观和行为有无异常,给药 周后测定大鼠体质量、摄食量。末次给药 后,腹腔注射 的戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹主动脉取血,使用 血细胞分析仪检测大鼠的血液学指标,包括白细胞计数()、红细胞计数()、血红蛋白()、血小板计数()和淋巴细胞计数()。使用 全自动生化分析仪检测血清生化指标,包括丙氨酸氨基转移酶()、谷氨酸氨基转移酶()、尿素氮()、肌酐()和血糖()。分离大鼠心脏、肝脏和肾脏,计算脏器系数(脏器质量 体质量 ),并进行 染色观察脏器形态。骨折大鼠模型的建立和分组处理参考文献 方法建立胫骨骨折模型。腹腔注射 的戊巴比妥钠麻醉大鼠。右后肢剃毛,在胫骨中上 交界处进行 的纵向皮肤切口,切开皮肤、皮
8、下组织和筋膜,暴露胫骨,将克氏针自胫骨下端逆行向上打入胫骨上端,用手术钳在胫骨 ,中上 处切断胫骨,然后缝合伤口。只大鼠共有 只建模成功,只死亡。将 只建模成功的大鼠随机分为 组:模型组、()白雀木醇组(组)和 ()白雀木醇组(组),每组 只。组和 组大鼠分别腹腔注射 的 ()和 ()的 白雀木醇,模型组大鼠腹腔注射 的 ,各组大鼠均给药 周。线检查和 分析大鼠胫骨骨折愈合情况各组大鼠治疗 周后,首先进行 线片检查大鼠胫骨骨折愈合情况。然后解剖并取出胫骨髓内钉,使用 系统扫描骨痂组织。番红 固绿染色评价骨折愈合情况分离大鼠胫骨,多聚甲醛固定 ,在 下用 脱钙 周,然后固定在 乙醇中。再使用 乙
9、醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋后切成 厚的切片。根据试剂盒说明对切片进行番红 固绿染色。检测骨痂组织中成骨相关基因和 信号通路相关基因转录使用 试剂提取大鼠骨痂组织的总 。使用 将 ()反转录为 。使用 在 实时荧光定量 仪上进行 分析。程序如下:,次循环。作为内参基因,通过 方法计算 相对表达量。基因特异引物见表 。表 引物序列 基因正向()反向()骨钙素()骨桥蛋白()相关转录因子 ()碱性磷酸酶()骨形态发生蛋白 ()无翅型 整合位点家族成员 ()无翅型 整合位点家族成员 ()连环蛋白()糖原合成酶激酶 ()检测骨痂组织中 信号通路相关蛋白表达使用 裂解缓冲液提取大鼠骨痂组织中的蛋白质并使
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