miR-30b-5p通过Sema3A调控HUVECs细胞增殖、凋亡、迁移与血管形成.pdf
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1、收稿日期:基金项目:山西省卫计委科研项目()作者简介:李志杰(),男,研究生,主治医师,主要从事甲状腺眼病及糖尿病足病的临床与基础研究.m i R b p通过S e m a A调控H U V E C s细胞增殖、凋亡、迁移与血管形成李志杰(国药同煤总医院内分泌科,山西 大同 )摘要:目的探究m i R b p对HUV E C s细胞增殖、凋亡、迁移与血管形成的影响及机制.方法培养的HU V E C s细胞进行不同处理:b l a n k组(正常糖培养)、HG组(高糖培养)、HGm i m i c N C组(高糖联合m i m i c N C转染)、HGm i R b pm i m i c组(高
2、糖联合m i R b pm i m i c转染)、HGm i R b pm i m i c o e N C组(高糖联合m i R b pm i m i c o e N C转染)、HGm i R b pm i m i c o e S e m a A组(高糖联合m i R b pm i m i c o e S e m a A转染).C C K 、流式细胞术、划痕实验、血管生成实验分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和血管形成.q R T P C R检测m i R b p、S e m a A mR NA表达.S t a r b a s e、T a r g e t s c a n、m i R D B网站预测m
3、 i R b p与S e m a A的靶向结合位点,双荧光素酶报告实验分析m i R b p对S e m a A的靶向调控.结果与b l a n k组比较,HG组HU V E C s细胞m i R b p表达下降,细胞增殖、迁移和血管形成能力降低,凋亡率增加(均P);与HGm i m i c N C组比较,HGm i R b pm i m i c组细胞的增殖、迁移和血管形成能力增强,凋亡率降低(均P);m i R b p靶向调控S e m a A;与HGm i R b pm i m i c o e N C组比较,HGm i R b pm i m i c o e S e m a A组细胞增殖、迁
4、移和血管形成能力降低,凋亡率增加(均P).结论m i R b p通过负调控S e m a A促进高糖介导的HUV E C s细胞增殖、迁移和血管形成,抑制其细胞凋亡.关键词:糖尿病足病;m i R b p;臂板蛋白 A多肽;靶向调控;血管生成中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:()D O I:/j c n k i n c d m m i R b pR e g u l a t e sP r o l i f e r a t i o n,A p o p t o s i s,M i g r a t i o na n dA n g i o g e n e s i s i nH U V E C s t
5、 h r o u g hS e m a AL IZ h i j i e(D e p a r t m e n t o fE n d o c r i n o l o g y,S i n o p h a r mT o n g m e iG e n e r a lH o s p i t a l,D a t o n g ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e T oe x p l o r et h ee f f e c to fm i R b po nt h ep r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s,m i
6、 g r a t i o na n da n g i o g e n e s i si nh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s(HUV E C s)a n di t sm e c h a n i s m s M e t h o d sHUV E C sw e r et r e a t e dw i t hn o r m a lg l u c o s e(b l a n kg r o u p),h i g hg l u c o s e(HGg r o u p),h i g hg l u c o s e c
7、o m b i n e dw i t hm i m i c N Ct r a n s f e c t i o n(HGm i m i c N Cg r o u p),h i g hg l u c o s ec o m b i n e dw i t h m i R b p m i m i ct r a n s f e c t i o n(HGm i R b p m i m i cg r o u p),h i g hg l u c o s ec o m b i n e d w i t h m i R b p m i m i co e N C t r a n s f e c t i o n(HG m
8、 i R b p m i m i co e N Cg r o u p),o rh i g hg l u c o s ec o m b i n e dw i t hm i R b pm i m i c o e S e m a At r a n s f e c t i o n(HGm i R b pm i m i c o e S e m a Ag r o u p)C e l lp r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s,m i g r a t i o na n da n g i o g e n e s i sw e r ed e t e c t e db
9、 yC C K a s s a y,f l o wc y t o m e t r y,s c r a t c ht e s t a n dt u b e f o r m a t i o na s s a y,r e s p e c t i v e l y T h ee x p r e s s i o no fm i R b pa n dS e m a A mR NA w a sd e t e c t e db yq R T P C R T h eS t a r b a s e,T a r g e t s c a na n dm i R D Bw e r ee m p l o y e dt op
10、 r e d i c tt h et a r g e t e db i n d i n gs i t e so fm i R b pa n dS e m a AD u a l l u c i f e r a s er e p o r t a s s a yw a sp e r f o r m e dt oa n a l y z et h et a r g e t e dr e g u l a t i o no fm i R b 南昌大学学报(医学版)年第 卷第期J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(M e d i c a lS
11、c i e n c e s),V o l N o po nS e m a A R e s u l t s C o m p a r e dw i t ht h eb l a n kg r o u p,t h ee x p r e s s i o no fm i R b pa n dt h ep r o l i f e r a t i o n,c e l lm i g r a t i o na n da n g i o g e n e s i so f c e l l sw e r e r e d u c e d,a n dt h ea p o p t o s i s r a t ew a s i
12、 n c r e a s e d i nHGg r o u p(P)C o m p a r e dw i t hHGm i m i c N Cg r o u p,t h ep r o l i f e r a t i o n,m i g r a t i o na n da n g i o g e n e s i so f c e l l sw e r e i n c r e a s e d,a n dt h ea p o p t o s i sr a t ew a sd e c r e a s e d i nHGm i R b pm i m i cg r o u p(P)m i R b pe x
13、 e r t e da t a r g e t e dr e g u l a t o r ye f f e c to nS e m a AC o m p a r e dw i t hHGm i R b pm i m i c o e N Cg r o u p,t h ep r o l i f e r a t i o n,m i g r a t i o na n da n g i o g e n e s i so f c e l l sw e r er e d u c e d,a n dt h ea p o p t o s i sr a t ew a se l e v a t e di n HGm
14、 i R b p m i m i co e S e m a Ag r o u p(P)C o n c l u s i o nm i R b pp r o m o t e sh i g hg l u c o s e m e d i a t e dp r o l i f e r a t i o n,m i g r a t i o na n da n g i o g e n e s i sa n ds u p p r e s s e sa p o p t o s i s i nHUV E C st h r o u g hn e g a t i v e l yr e g u l a t i n gS
15、e m a AK E Y WO R D S:d i a b e t i c f o o t;m i R b p;S e m a A;t a r g e t e dr e g u l a t i o n;a n g i o g e n e s i s糖尿病足病是糖尿病患者常见的严重慢性并发症之一,患者常出现局部神经异常,伴有下肢远端外周血管病变相关的足部感染、溃疡和(或)深层组织破坏.其发病原因包括感觉运动和自主神经病变、周围 血 管 病 变、关 节 活 动 受 限 和 局 部 压 力 增加.糖 尿 病 足 病 患 者 易 出 现 糖 尿 病 足 溃 疡(D F U),若溃疡并发感染将影响伤口愈
16、合.伤口愈合是一个复杂而有序的过程,包括凝血、炎症、细胞增殖和组织重塑四个互有重叠的阶段,其中新生血管的形成十分关键,其能够提供氧气和营养、促进碎片清除和伤口愈合.微小R NA(m i R NA s)是一种内源性非编码小R NA,长度约为 个核苷酸,通过特异性结合下游靶mR NA的 UT R区域来调节基因表达.有研究表明,糖尿病影响m i R NA s表达,而m i R NA s与糖尿病微血管和大血管并发症的发生密切相关.有研究报道,m i R b p在胰岛素敏感和胰岛素抵抗人群的皮下脂肪组织中呈差异性表达,提示m i R b p可能在糖尿病发生过程中起作用.臂板蛋白 A多肽(S e m a
17、A)是S e m a家族的成员,其家族已鉴定出 多种类型,S e m a A在心脏发育、血管生成、肿瘤转移、破骨细胞生成和免疫调节中均发挥 作 用.本 研 究 以 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞HUV E C s为研究对象,观察m i R b p是否通过S e m a A影响HUV E C s细胞的增殖、凋亡、迁移与血管形成,旨在为糖尿病足病伤口愈合机制的研究提供实验依据.材料与方法主要试剂与仪器人脐静脉内皮细胞HUV E C s购自美国模式培养物研究所;F B S、青霉素/链霉素均购自美国G i b c o公司;DMEM培养基、T r i z o l购自美国I n v i t r o g e
18、 n公司;高糖(mm o lL)购自美国S i g m a公司;C C K 溶液及凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;M a t r i g e l购自B e c t o n D i c k i n s o n公司;R NA提取试剂盒购自北京天根生化科技有 限 公 司;S u p e r S c r i p t 试 剂 盒、P o w e r U pTMS Y B RTMG r e e nM a s t e rm i x均购自美国赛默飞公司;荧光素酶载体p G L 及双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自普洛麦格生物技术有限公司.L i P o f e c t a m i n e 购 自 美
19、国I n v i t r o g e n公 司;m i m i cN C、m i R b pm i m i c、p c D NA N C、p c D NA S e m a A均购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司;多功能酶标仪购自美国B i o T e k公司;流式细胞仪及A B IV i i AS y s t e m均购自美国赛默飞公司.方法细胞培养与处理HUV E C s细胞用正常葡萄糖(mm o lL)或高糖(mm o lL)添加 F B S和青霉素/链霉素DMEM培养基培养,取对数期生长细胞用于后续实验.HUV E C s细胞进行种不同处理:b l a n k组:正常葡萄糖培养的HUV
20、 E C s细胞;HG组:高糖培养的HUV E C s细胞;HGm i m i c N C组:高糖培养HUV E C s细 胞 转 染m i m i c N C;HGmR b pm i m i c:高糖培养HUV E C s细胞转染m i R b pm i m i c;HGm i R b p m i m i co e N C组:高糖培养HUV E C s细胞共转染m i R b p m i m i c及p c D NA N C;HGm i R b p m i m i co e S e m a A组:高 糖 培 养HUV E C s细 胞 共 转 染m i R b pm i m i c及p c
21、D NA S e m a A.C C K 实验各组以 个孔细胞密度接种于 孔板中,待细胞贴壁后,培养、h后加入 LC C K 溶液处理h.使用多功能酶标仪测李志杰:m i R b p通过S e m a A调控HUV E C s细胞增殖、凋亡、迁移与血管形成定各孔 n m处的O D值.流式细胞术各组细胞用 胰蛋白酶消化后按照细胞凋亡试剂盒说明书,用 L结合缓冲液将细胞重悬,依 次 向 细 胞 中 加 入A n n e x i n V(L)和P I(L),并在室温下避光孵育 m i n.使用流式细胞仪检测细胞凋亡,M o d F i L T软件(版本)分析细胞凋亡率.细胞划痕实验各组以 个孔细胞密
22、度接种于六孔板中,培养至约 融合后使用 L无菌微量移液器吸头进行划痕,用P B S清洗细胞次,并用无血清培养基继续培养.在划痕后、h分别在相同位置用倒置显微镜拍照,每组采集个独立视野图像.使用I m a g e J软件对划痕的宽度进行定量,评估迁移情况.血管形成实验 孔板中加入 L液化M a t r i g e l,将孔板置于 下,直至M a t r i g e l凝固.然后,将各组细胞接种于 孔板中.h后,使用倒置显微镜观察HUV E C s的管状分枝形成情况并拍照.使用I m a g e J软件对血管的分枝数目及长度进行量化.实时定量P C R(q R T P C R)各组以 个孔细胞密度
23、接种于孔板中,R NA提取试剂盒提取总R NA,S u p e r S c r i p tI V试 剂 盒 进 行 逆 转 录 合 成c D NA,P o w e r U pTMS Y B RTMG r e e nM a s t e rm i x和A B IV i i AS y s t e m进行q R T P C R.P C R条件:初始变性 s,变性 s,延伸 s,循环 次.用 C T方法 进行定量,U 作为m i R b p的内参,GA P DH作 为S e m a A的 内 参.引 物 序 列 见表.表引物序列引物名称序列()m i R b p FC C GAAA C A T C C
24、T A C A C T C A G C T AAm i R b p RC A G T G C G T G T C G T G GA G TS e m a A FC C C T G GAA G T C A T T GA C A C A GS e m a A RG G T A T G T C C T G G C C T T T G C C GGA P DH FC AAG C AA C T G T C C C T GAGGA P DH RTA GA C A GAA G G T G G C A C AU FAT T G GAA C GA T A C A GA GAA GU RG GAA C G C T
25、 T C A C GAA T T T G双荧光素酶报告实验于S t a r b a s e(h t t p s:/s t a r b a s e s y s u e d u c n/)、T a r g e t s c a n(h t t p:/www t a r g e t s c a n o r g/v e r t_/)、m i R D B(h t t p:/m i r d b o r g/)网站进行m i R b p和S e m a A的靶向结合位点预测分析,将结合序列及突变的 序列分别克 隆至 荧 光 素 酶 载 体p G L 中构建野生型(S e m a A WT)和突变型(S e m
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- 关 键 词:
- miR 30 通过 Sema3A 调控 HUVECs 细胞 增殖 迁移 血管 形成
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