LINC01296调控Wnt_β-catenin通路对卵巢癌顺铂耐药的影响.pdf
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1、():.:.():.():.:.():./.():./:.():./(/).:./.():.:.:.():.(编校:蔺玥)调控/通路对卵巢癌顺铂耐药的影响林芳婷吴清瑜王 茹李 波海南省妇女儿童医学中心妇科海南 海口【摘要】目的:探究长链非编码 调控/连环蛋白()通路对卵巢癌顺铂耐药的影响 方法:培养人卵巢癌 细胞及 顺铂耐药/细胞 检测 在二者中的表达情况将/细胞分为 组:组(正常培养)、组(转染 )、组(转染 )、组(转染 /通路激动剂 /处理)、组(转染 /处理)验证转染效果 法检测各组/细胞顺铂半数抑制浓度()(、/顺铂处理)及增殖活力流式细胞术检测各组/细胞凋亡划痕愈合实验检测各组/细
2、胞迁移能力 检测各组/细胞中/通路及增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白 细胞淋巴瘤/白血病基因 相关 蛋白基因()基质金属蛋白酶()神经型钙黏附蛋白()表达情况 结果:在/细胞中的表达水平明显高于 细胞(.)/细胞转染 后 表达水平较 组、组明显下降(.)表明转染成功与 组比较 组/细胞顺铂、增殖活力、细胞划痕愈合率、侵袭数均下降凋亡率增高 、蛋白表达均减少 蛋白表达增加(.)与 组比较 组/细胞顺铂、增殖活力、细胞划痕愈合率、侵袭数均增高凋亡率下降 、蛋白表达均增高 蛋白表达下降(.)结论:敲低 表达可降低/细胞对顺铂的耐药性可能通过抑制/通路实现【关键词】长链非编码 /通路卵巢癌顺铂耐药【中图
3、分类号】.【文献标识码】:./.【文章编号】()【收稿日期】【修回日期】【基金项目】海南省卫生计生行业科研项目(编号:)【作者简介】林芳婷()女海南海口人主治医师研究方向:卵巢癌 :.林芳婷等 调控/通路对卵巢癌顺铂耐药的影响 /.【】:/.:/./:()()()(/)(/).()/(/)././././()()/.:/(.)./(.)./(.)./(.).:/.【】/():卵巢癌是一种妇科常见的恶性肿瘤具有高发病率、高复发率、高死亡率的特点 目前顺铂耐药已成为卵巢癌患者成功治疗的最重要障碍之一 因此揭示卵巢癌化疗耐药的病理机制具有重要的临床价值 长链非编码()在癌症发生发展中的作用越来越被人
4、们所重视 研究已表明 可通过直接或间接多种途径调控癌症相关基因的表达而影响其恶性生物学行为且一些 已被证明是许多癌症诊断和预后的潜在标志 为 家族新发现的成员位于.染色体上其已被证实在许多癌症中过表达如胃癌、食管鳞癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、口腔癌、神经母细胞瘤等可加速肿瘤的恶性进展 此外有报道称 在卵巢癌中亦过表达且可作为卵巢癌患者诊断及预后的有前景的指标 但到目前为止尚无研究报道 在卵巢癌化疗耐药中的作用及可能机制/连环蛋白()通路调控包括卵巢癌在内的多种癌症的生存、转移及化疗耐药 此外大量研究表明一些 在癌症中的作用与调控/通路有关如 、等 基于上述内容本研究通过体外培养人卵巢癌 顺铂耐药
5、细胞(/)观察 对/细胞顺铂耐药的影响并探究其潜在的分子机制以期为化疗耐药卵巢癌的治疗提供参考 材料与方法.材料 细胞、/细胞(货号分别为 、均上海烜雅生物科技有限公司)顺铂、/通路激动剂(货号分别为、上海联硕生物科技有限公司)小干扰()及其阴性对照()由武汉淼灵生物科技有限公司构建 胎牛血清()(货 号西安中团生物科技有限公司)、(货号分别为 、均上海北诺生物科技有限公司)、引物序列购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司反转录试剂盒、试剂盒(货号分别为、均 公司)试剂盒、/试剂盒(货号 、均杭州联科生物技术股份有限公现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .司)(基底胶)、小室购自美国 公司(货
6、号分别为、)裂解液、试剂盒(货号分别为、均 公司)兔源一抗 、细胞淋巴瘤/白血病基因 相关 蛋白基因(/)、基质金属蛋白酶 ()、神经型钙黏附蛋白()(货号分别为、均 公司)兔源一抗、标记的 山羊抗兔二抗、发光液(货号分别为、均 生物科技公司).细胞的培养及分组、/细胞均采用 培养基(含 青 链霉素双抗、)于、含培养箱中常规培养待细胞密度约 时收集 将/细胞以 个/接种至 孔板中待密度达 时利用 进行转染实验设计分组如下:组(不进行任何转染)、组(将 转染至/细胞)、组(将 转染至/细胞)、组(转染 /处理)、组(转染 /处理)继续培养 而后进行后续实验.检测 细胞及各组/细胞中 表达情况采用
7、 法从.细胞及各组/细胞中提取 并进行反转录合成 而后以 为模板进行扩增以 为内参经 法分析 表达情况 引物序列:()():()().法检测各组/细胞顺铂半数抑制浓度()和增殖活力收集.各组/细胞以 个/孔接种至 孔板中 后分别加入、/顺铂处理 而后加入 试剂孵育 借助 酶标仪测定 波长处的吸光度(值)经 .软件计算顺铂 收集.各组/细胞以 个/孔接种至 孔板中 后加入 试剂孵育 借助酶标仪测定 值细胞增殖活力与 值成正比.流式细胞术检测各组/细胞凋亡将.各组/细胞继续培养 而后以 个/管转移至流式管中分别加入 ()和()孵育 上流式细胞仪()检测细胞凋亡率.划痕愈合实验检测各组/细胞迁移能力
8、弃去.各组/细胞的培养基用 枪头在孔中间竖着划一条直线 清洗后加入新培养基继续培养 而后于 显微镜下拍照 软件对图像进行分析计算划痕愈合率.实验检测各组/细胞侵袭能力收集.各组/细胞分别用不含 的培养基制备细胞悬液(个/)取 接种至 小室(已预先包被)中 孔板中加入 含有 的培养基 后甲醛将侵入膜下表面的细胞固定 随后用棉签拭去上表面的细胞 清洗后结晶紫染液(.)染色 于显微镜下计数细胞数量即为侵袭数量.检测各组/细胞中 、蛋白表达 裂解液提取各组/细胞总蛋白测定蛋白浓度后利用凝胶电泳分离蛋白随后转模、封闭在 下将膜与兔源一抗 ()、()、()、()、()、()孵育过夜次日在室温下将膜与 山羊
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