Crispr-Cas12a法快速检测脑胶质瘤异柠檬酸脱氢酶1基因突变的效能研究.pdf
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1、论著283临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第4期Crispr-Cas12a法快速检测脑胶质瘤异柠檬酸脱氢酶1基因突变的效能研究冯哲斌,孔东生,冯世宇,余新光【摘要】目的运用Crispr-Cas12a法快速检测冰冻脑胶质瘤组织样本中异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因R132H单核苷酸多态性,初步评价该方法的检测效能及其与直接测序方法的一致性。方法选择30 例脑胶质瘤冰冻组织样本,分别使用Crispr-Cas12a法、免疫组织化学法(IHC)以及直接测序法对样本IDH1-R132H位点突变情况进行检测,计算Crispr-Cas12a法的灵敏度、特异性等效能指标,并利用配对检验(McNema
2、r检验)及Kappa一致性检验分析Crispr-Cas12a法、IHC法与金标准(直接测序方法)的一致性。结果禾利用Crispr-Cas12a法初步实现了6 0 min内对冰冻脑胶质瘤组织样本IDH1-R132H位点突变的快速检测。以直接测序为金标准,Crispr-Cas12a法的灵敏度为8 7.7%,特异性为97.0%,一致性为91.1%,Kappa一致性检验显示两种方法一致性较好(k=0.816)。结论Crispr-Cas12a法能快速、准确地对冰冻脑胶质瘤组织样本IDH1-R132H突变进行检测,且稳定性较好,有望成为一种检测IDH1突变的术中检测方法。【关键词】异柠檬酸脱氢酶1;Cri
3、spr-Cas12a;即时检测【中图分类号】R739.41【文献标识码】A【文章编号】10 0 4-16 48(2 0 2 3)0 4-0 2 8 3-0 6Efficacy of Crispr-Cas12a in rapid detection of isocitrate dehydrogenase 1 gene mutation in gliomaFENGZhebin,KONG Dongsheng,FENG Shiyu,et al.Senior Department of Neurosurgery,the First Medical Center of PLAGeneral Hospita
4、l,Beijing 100089,ChinaAbstract:ObjectiveThe Crispr-Cas12a method was used to rapidly detect the R132H single nucleotidepolymorphism of the isocitrate dehydrogenase 1(IDHI)gene in frozen glioma tissue samples,and the detectionefficiency of this method and its consistency with the direct sequencing me
5、thod were preliminarily evaluated.MethodThirty cases of glioma frozen tissue samples were selected,and the IDH1-R132H mutation was detected by Crispr-Cas12a method,immunohistochemistry(IHC)and direct sequencing method respectively.The sensitivity andspecificity of Crispr-Cas12a method were calculate
6、d,and the consistency of Crispr-Cas12a method,IHC method andthe gold standard(direct sequencing method)was analyzed by pairedx test(MeNemar test)and Kappa consistencytest.Result The rapid detection of IDH1-R132H mutation in frozen glioma tissue samples within 60 min waspreliminarily realized by Cris
7、pr-Cas12a method.With direct sequencing as the gold standard,the sensitivity of theCrispr-Cas12a method was 87.7%,the specificity was 97.0%,and the consistency was 91.1%.The Kappaconsistency test showed that the two methods had good consistency(k=0.816).Conclusion Crispr-Cas12a methodcan quickly and
8、 accurately detect IDH1-R132H mutation in frozen glioma tssue samples,and has good stability,which is expected to become an intraoperative detection method for IDH1 mutation.Key words:isocitrate dehydrogenase l;Crispr-Cas12a;point-of-care脑胶质瘤是最常见的颅内原发恶性肿瘤1,全球每年发病率为5/10 0 0 0 0 6/10 0 0 0 0 2 。目前胶质瘤首
9、选的治疗手段是最大范围的安全切除34。肿瘤切除程度、残余肿瘤体积是影响患者预后的重要因素56 。但由于胶质瘤浸润生长的特性,肿瘤与周围正常脑组织往往没有明确边界7 ,这为手术切除范围的确定带来极大的挑战。不同分子亚型的成人弥基金项目:特殊装备科研(LB20201A060004)作者单位:10 0 0 8 9北京,中国人民解放军总医院第一医学中心神经外科医学部通信作者:余新光漫性胶质瘤的切除范围不能一概而论。除组织学病理分型外,胶质瘤手术策略的制定还取决于诸如异柠檬酸脱氢酶(IDH)、A T R X、T ER T、染色体1p/19q等分子特征8 。其中,IDH是胶质瘤最重要的分子标志物之一9,术
10、前或术中知晓IDH分子状态对个体化手术意义重大。成簇规律间隔短回文重复序列(Crispr)及Crispr相关(Cas)蛋白是原核生物基因组内靶向降解外源核酸的一段重复序列和核酸酶10-。Crispr-Cas12a(Cp f 1)系2 0 15年由张锋团队12 1 首次发现并报道。Cas12a是一种RNA引导的核酸内切酶,由一个与靶284J Clin Neurol,August 2023,Vol.36,No.4双链DNA(d s D NA)互补的自身来源RNA(c r R NA)引导,在与靶dsDNA结合后,即表现出强大的、无差别的切割单链DNA(s s D NA)活性,在切割dsDNA的同时(
11、称“顺式切割”)触发携带荧光团和猝灭剂的短ssDNA报告基团的侧支裂解(称“反式裂解”),使灭剂与荧光团分离,产生荧光信号1314。本研究采用Crispr-Cas12a方法、直接测序方法和免疫组织化学法(IHC)对30 例冰冻胶质瘤组织样本进行IDH1-R132H位点突变情况检测,验证基于Crispr-Cas12a工具进行冰冻胶质瘤组织样本IDH1-R132H位点突变(c.395GA)即时检测(POCT)的可行性。1材料与方法1.1样本来源及纳排标准选择2 0 19 年12 月1日至2 0 2 0 年1月31日解放军总医院第一医学中心神经外科手术切除的初治脑胶质瘤标本(术后标本液氮冻存于解放军
12、总医院标本库)30 例。纳人标准:(1)年龄18 岁,术后病理证实为WHO24级成人弥漫性胶质瘤(参考WHO2021中枢神经系统肿瘤分类8 ),肿瘤标本进行直接测序检测;(2)术后2 4h内标本放置于冻存管,低温液氮保存,使用前未进行冻融;(3)患者或家属签署知情同意书。排除标准:(1)同时患除胶质瘤外的其他恶性肿瘤;(2)术前曾行针对胶质瘤的放化疗、电场治疗、生物治疗等;(3)同时伴有严重细菌、真菌、病毒感染性疾病、传染病。本研究的样本采集、使用已通过解放军总医院第一医学中心伦理委员会审批。1.2主要试剂及仪器HiScribe T7 Quick HighYieldRNA合成试剂盒(NEB,I
13、p s w i c h,美国)、TRleasy TM Total RNA Extraction Reagent TRleasy M 总RNA提取试剂翌圣生物科技(上海)股份有限公司)、Fncas12a(江苏博嘉生物医学科技有限公司)、水浴锅、高速冷冻离心机、V1掌上型快速荧光检测仪(江苏博嘉生物医学科技有限公司)。1.3方法所有样本编号后,使用Excel中的RAND()函数生成随机数,并进行排序,依排序顺序进行Crispr-Cas12a检测。由两名检测员完成全部30 例样本检测,检测员不知晓样本IDH突变情况。每例标本使用Crispr-Cas12a方法平行重复检测3次以检验此方法的稳定性。采用
14、IHC和直接测序(Sanger测序或二代测序)参考患者术后的检测结果。所有数据录人2 遍统计学软件。1.3.1试剂制备及体系验证(1)引物设计和crRNA制备:选择IDH1-R132H作为检测位点。参照特异性检测位点区域设计野生型和突变型模板,设计PCR扩增引物,同时针对这些突变区域设计crDNA并合成所需的寡核苷酸crRNA。c r D NA 与T7-crRNA-F混合后,按照双链靶标的步骤退火制备转录模板(10 0,10 min,然后自然冷却)。转录模板使用HiScribeT7QuickHighYieldRNA合成试剂盒(NEB,Ip s w i c h,美国)无酶条件下37 孵育16 h
15、。反应完成后加人2 lDNase1(天根生物)消除体系中未反应的模板,纯化得所需的crRNA。突变型模板序列、扩增引物及crDNA由苏州金唯智生物科技有限公司合成。crDNA、引物、IDH野生型及突变型靶标信息见表1。(2)扩增体系和条件:遵循程序95180s;9510 s,58 2 0 s,30 次循环;2 52 s。(3)Cr i s p r-c a s 12 a 荧光检测体系验证:检测蛋白为Fncas12a。Fn c a s 12 a 使用5-KYTV-3作为原间隔子相邻基序(PAM)。将合成的靶标模板(15l)加人检测试剂混合液(含有0.7 5molcrRNA、1.5molFncas1
16、2a、50 p m 荧光探针及3l的NEBuffer2.1,最后加无酶水补充体积至10 0 l)于荧光检测仪中37反应0.5h,读取荧光值,分析荧光曲线。全部反应均在37 42 下恒温进行。1.3.2临床样本检测1.3.2.1样本处理在未解冻情况下剪取少许肿瘤冰冻组织(约0.1ml),常温下融化,使用快速DNA提取检测试剂盒(天根生物)进行DNA快速提取。加人A1Buffer50l,将组织充分研磨、振荡后,常温下裂解10 min,加人A2Buffer50l,离心。1.3.2.2试剂准备使用常规引物进行PCR,并以5l样本上清为模板。将扩增混合物转人反应耗材储液管中,通过耗材上设计的连通位将混合
17、液甩入下表1ccrDNA、上下游引物及IDH野生型、突变型靶点序列项目序列IDH1-crDNA5-GGC ATC ATG CTT ATG GGG ATA TCT ACA AGA GTA GAA ATT ACC CTA TAG TGA GTC GTA TTA ATT TC-3IDH1上游引物5-GCAGAAGCTATAAAGAAGCATAATGTTG-3IDH1下游引物5-AAA TCA CAT TAT TCC CAA CAT GAC TTA C-3T75-GAA ATT AATACG ACT CAC TAT AGG G-3IDHwt靶点5-TTA CTT GAT CCC CAT AAG CAT
18、 GAC GAC CTA TGA TGA TAG GTT TTA CCC ATC CAC TCA CAA GCC G-3IDHmut靶点5-TTA CTT GAT CCC CAT AAG CAT GAT GAC CTA TGA TGA TAG GTT TTA CCC ATC CAC TCA CAA GCC G-3285临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第4期管反应仓。上述操作完成后将耗材卡扣转到锁止位,使上下管连通断开。将检测混合液共50 l(包含纯化的Cas12a、c r R NA、荧光探针、DNA酶抑制剂和无酶水)加人耗材上层储液管。1.3.2.33目的基因扩增及Crispr-ca
19、s12a荧光检测使用V1掌上型快速荧光检测仪(博嘉生物)进行上机检测。扩增遵循程序:9518 0 s;9510 s,582 0 s,2 5次循环;2 52 s。扩增反应完成后,通过连通位将检测混合液甩人下管反应仓后,插入仪器对应卡槽位置开始检测反应。反应程序:37,1min,30次循环,每1min采集一次荧光。反应全部结束后待统计分析检测反应(37)内反应前后荧光值的变化情况(即相对荧光值),根据阴性阈值判断待测样本DNA中是否存在待检突变基因。1.3.3IHC检测与直接测序所有患者均采用IHC和直接测序法检测IDH1-R132H突变情况。IHC检测采用EnVision法,由解放军总医院第一医
20、学中心病理科完成,超过10%肿瘤细胞被染色视为IDH1-R132H突变型;报告“部分阳性”“点片状阳性”、“可疑阳性”、“弱阳性”等均视为IDH1-R132H野生型。直接测序使用一步法多重PCR扩增联合下一代测序(NGS)或Sanger测序进行IDH1-R132H位点突变检测,委托北京泛生子基因科技有限公司完成。1.3.4统计学方法应用SPSS22.0软件进行统计学分析。以直接测序方法为诊断金标准,评价Crispr-Cas12a方法和IHC法的诊断效能。依据相对荧光值绘出Crispr-cas12a方法的ROC曲线,得到IDH1-R132H突变型和野生型样本相对荧光值的最佳截断值;利用诊断实验四
21、格表计算Crispr-Cas12a方法的灵敏度、特异性和一致性。利用曲线下面积(AUC)评估此方法的检测水平:0.9为优秀,0.7 0.9为一般,0.75为二者一致性较好,0.4Kappa0.75为二者一致性一般,Kappa0.4为二者一致性较差。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.11IDH野生型组及IDH1-R132H突变型组临床资料的比较交见表2。30 例胶质瘤冰冻样本中,IDH1-R132H突变型19例,IDH野生型11例。两组间年龄、WHO分级和不同脑叶病灶部位差异有统计学意义(均P0.05);K a p p a 值为0.8 16,与直接测序一致性较好。IHC法检测R132H突
22、变情况:灵敏度为94.7%(95%CI:75.499.1),特异性为10 0%(95%CI:74.1100),一致性为96.7%(95%CI:83.399.4)(表4)。McNemar检验提示IHC法与直接测序结果无统计学差异(P190GC1.42:0L90GT300图5IDH1-R132H突变型与IDH野生型结果A、C、E:ID H-R 132 H 位点突变胶质瘤样本的免疫组织化学法、Crispr-Cas12a法以及Sanger测序结果;B、D、F:ID H 野生型胶质瘤样本的免疫组织化学法、Crispr-Cas12a法以及Sanger测序结果。287临床神经病学杂志2 0 2 3年第36
23、卷第4期0.05);K a p p a 一致性检验显示,IHC法Kappa值为0.930,与直接测序一致性良好。表3Crispr-Cas12a法与直接测序法在IDH1-R132H检测中的一致性分析例(%)Crispr-直接测序Casi2a阳性阴性阳性50(87.7)1(0.3)阴性7(12.3)32(96.7)总计5733表4IHC法与直接测序法在IDH1-R132H检测中的一致性分析例(%)直接测序IHC阳性阴性阳性18(94.7)0(0)阴性1(5.3)11(100.0)总计19113讨 论IDH是脑胶质瘤最重要的分子标志物,IDH基因状态往往与患者预后密切相关,并且可以指导胶质瘤手术的切
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