ADC药物配体结合生物分析常见技术问题探讨.pdf
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1、书书书 ,专家论坛 作者简介 秦秋平,男,正高级工程师,研究方向:大分子药物生物分析方法学及其应用;治疗 预防性抗体和病原体疫苗的免疫原性研究技术开发。:通讯作者 宫丽?,女,研究员,博士生导师。研究方向:免疫毒理学,创新药物非临床安全性评价关键技术开发与应用。:;闫莉萍,女,博士,主任药师。研究方向:药物非临床研究技术审评。:药物配体结合生物分析常见技术问题探讨秦秋平,陶亦敏,刘婷婷,闫莉萍,宫丽?(中国科学院上海药物研究所药物安全评价与研究中心,上海 ;国家药品监督管理局药品审评中心,北京 )摘要 目的:抗体药物偶联物()是一类新的生物治疗药物,通常由细胞毒性有效载荷通过连接子与抗体共价结
2、合组成。在体内经历不断的脱偶联和生物转化过程,导致形成复杂且结构不均一的混合物,除了脱偶联的游离抗体和游离载荷外,还存在不同程度与小分子药物偶联的 分子,因此,对生物分析方法的开发带来很大挑战。为了解 药物在非临床和临床研发阶段的药代和药效特征,以及免疫原性和安全性,对给药后体内存在的不同分子形式的实体比如药物偶联的抗体、裸抗和总抗体等需要使用不同的方法进行分析。本文总结了在 药物分析方法开发中遇到的较为常见的技术问题并提供相关的解决方案,以期为相关的分析方法开发提供参考,促进 药物安全有效地开发。关键词 抗体偶联药物;配体结合分析;药代;抗药抗体;生物分析 中图分类号 文献标志码 文章编号
3、(),(,;,)(),;大分子生物药近年来迅猛发展,特别是抗体药物偶联物(,)是药物市场增长最快的生物药之一,药物在肿瘤的靶向治疗中发挥着重要的作用。药物结构不同(抗体结构、靶点、药物载荷、连接子和药物抗体比),在体内的表现和给药策略也不一样。了解这些药物在非临床和临床研发阶段的药代和药效特征,以及免疫原性和安全性,可以对 在体内的作用机制和生物过程进行准确和全面的评估,从而促进安全有效的 药物的开发。生物分析为非临床和临床研究提供各种关键数据,用于计算和评估各种药代 毒代等参数指标,是药物开发中的重要环节。药物的生物分析方法应稳健 年第 卷第 期和可靠,满足特定研究相关的样品检测需要,能为非
4、临床和临床研究提供准确的数据。药物因体内代谢复杂,构建合适的 生物分析方法需要考虑众多不同的因素。如对于定量的分析方法,首先要遵循等分子检测的原则,即在相同的分析条件下,一分子的标准品产生的检测信号与一分子的待测物产生的检测信号应该相同。其次需要明确待分析的分子是游离形式还是总分子,是完整分子还是部分分子。此外,要了解各个关键试剂对不同状态下的 药物分子的结合反应性,基质中是否有游离靶标和结合蛋白的存在;并需要了解类似物与代谢物的情况,以及方法对抗药抗体的耐受程度等 ,。在本中心的生物分析实践中,不失为一类对生物分析方法的开发具有很大挑战性的药物。由于经历分解代谢和生物转化过程,导致 药物在体
5、内具有异质性,存在着多种形式 分子以及多个 药物的组成分子。因此,对 药物的分析需要包含 以及不同的组分,涉及到多种分析方法。本文例举在 药物配体结合生物分析方法开发工作中遇到的较为常见的技术问题并提供相关的解决方案,以期为生物分析人员提供参考,保障 药物评价相关生物分析数据的准确性。使用合适的分析方法模式使用不合适的分析方法模式的错误一般会出现在 ()方法中,特别是对药物偶联抗体的检测。除了脱偶联的游离抗体和游离载荷外,在血基质中的异质性主要表现为存在不同程度与小分子药物偶联的 分子。对于不同分子形式的分析物实体,比如药物偶联的抗体、抗体偶联的药物、总抗体、未偶联的抗体(裸抗)和游离药物分子
6、,需要使用独立的方法进行分析。通过比较药物偶联抗体与总抗体的水平可以了解 脱偶联的程度,而通过比较抗体结合的药物分子与总抗体的水平可以得到 的平均 ()值 。用于分析药物偶联抗体合适的分析方法应以抗小分子药物的抗体作为包被试剂,再以标记的药靶分子或者抗 药物的独特型抗体或抗人 抗体作为检测试剂,见图 。该检测方法模式体现了等分子检测的原则,保证了对药物偶联抗体的准确检测。图 合适的方法模式用于分析 中的药物偶联的抗体用于分析药物偶联抗体的不合适的分析方模式以靶标或者抗 药物的独特型抗体或者抗人 抗体作为包被试剂,再以标记的抗小分子药物作为检测试剂,见图 。这种方法产生的结合信号除了反映 分子的
7、数量外,还受到 分子中小分子数目的影响,该分析模式违反了等分子检测的原则,最终将导致药物偶联的抗体的检测不准确。图 不合适的方法模式用于分析 中的药物偶联的抗体 ,专家论坛 总抗体分析方法受 值的影响 总抗体的检测中包含对药物偶联的抗体和药物未偶联的抗体(裸抗)两种组分的分析,其中药物偶联的抗体存在异质性。在构建总抗体的分析方法时,应避免使用对偶联抗体和裸抗存在差异结合的关键试剂,否则总抗体分析方法的准确性会受到影响 。在图 的方法 中以靶抗原作为包被试剂,以标记的抗人 为检测试剂,结果显示未偶联抗体的结合信号明显高于药物偶联的抗体的结合信号,说明方法 中的关键试剂对药物偶联的抗体和裸抗的结合
8、反应存在差异;然而,当方法 中的标记抗体更换为标记的抗人 的抗体时,未偶联抗体的结合信号与药物偶联的抗体的结合信号基本一致(方法 ),说明方法 中的关键试剂对药物偶联抗体和裸抗的结合反应不存在差异,是检测总抗体的正确方法。综合 种方法的检测结果,可见造成方法 中的未偶联抗体和偶联抗体的结合信号差异的原因来自标记的抗人 试剂。绿色曲线代表未偶联的抗体,而红色曲线代表偶联的抗体图 对总抗分子的检测 分析方法受 值的影响对于 分子而言,给药后体内 值因脱偶联而随时间变化,总体来说,值在 给药后趋向变小。因此,导致定量分析的 参考标准品与体内研究样品中的 的 值互不相同,这种差异在给药后期(比如 试验
9、)的时间点采集的样品中表现得尤为明显。如果在 检测中使用的关键试剂受到 值不同的影响,那么 的浓度将不能代表分析物的真实浓度,从而影响研究数据的解读 。图 中所示的 分析方法是以抗小分子药物的 ()作为捕获试剂,抗人 的抗体作为检测试剂来构建的。结果发现方法在 值为 以下时影响较小,但当 值增加到 时,信号值明显下降。因此,采用 值为 的 作为标准品开发的分析方法基本不受 值的影响。另一个例子中的 分析方法以抗小分子药物作为捕获试剂,靶蛋白和靶蛋白表面的标签以及标记的抗标签抗体为检测试剂,见图 。这里的标记试剂利用了靶蛋白分子上的标签分子,而不是直接使用生物素或 标记的靶蛋白作为检测试剂,原因
10、是生物素或 标记的靶蛋白显著地失去了与 结合的能力。相关的实验结果显示,以 值为 的 作为分析的参考标准品时,值为 的 的检测未见受到影响。该项目中未能获得 值为 的 测试物用于更低 值影响的评估,但由于 值为 和 时时 与靶蛋白的结合相当,鉴于该 分子为定点偶联产品,故认为在低 值情形下 与靶蛋白的结合很大概率不会受到影响。年第 卷第 期图 值对 分析方法的影响()图 值对 分析方法的影响()的分析方法受小分子状态的影响 生物分析的挑战性还可源于与抗体偶联的小分子的状态。在体内经历的生物转化和分解代谢过程可能使 分子上的小分子毒素的结构发生改变,生成小分子毒素代谢转化后的细胞毒性增加或降低的
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