长链非编码RNA MALAT1对人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响.pdf
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1、作者简介 常清(1992-),女,河南南阳人,主治医师,医学硕士,研究方向为呼吸内科病的诊治。通讯作者 乔华,Tel:0377-3310297,Email:。长链非编码RNA MALAT1对人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响常清1,陈飞1,张铁栓2,乔华1,万军营3(1.南阳市第一人民医院呼吸与危重症医学一科,河南南阳 473004;2.郑州大学第二附属医院呼吸内科,郑州 450014;3.郑州市中牟县人民医院呼吸与危重症医学科,郑州 451450)摘要 目的探索长链非编码 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)肺腺癌转移相关转录本 1(metastasisassoc
2、iated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)对人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。方法培养人肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1,HFL1),按照有无转化生长因子1(transforming growth factor1,TGF1)作用分为观察组和对照组,检测两组细胞中 lncRNA MALAT1 表达水平。在此基础上设置四个组别:空白组、TGF1 组、转染对照组和 siMALAT1 组。空白组细胞不接受任何处理;TGF1 组采用 5 ug/L 的 TGF1处理;转染对照组在 TGF1 组的基础上应用 si
3、MALAT1 阴性对照(negative control,NC)处理;siMALAT1 组在TGF1 组的基础上应用 siMALAT1。比较其 lncRNA MALAT1、型胶原(collagen 1,COL1)和 平滑肌肌动蛋白(smooth muscle activation protein,SMA)的 mRNA 表达水平,COL1 和 SMA 的蛋白表达水平和细胞增殖情况。结果观察组 lncRNA MALAT1 相对表达量较对照组高(P0.05)。四组细胞 lncRNA MALAT1、SMA 和COL1 的 mRNA 及蛋白相对表达量有统计学差异(P0.05);其中,转染对照组和 TGF
4、1 组以上 RNA 和蛋白相对表达量均高于 siMALAT1 组和空白组(P0.05)。四组细胞增殖活力的差异具有统计学意义(P0.05);转染对照组和 TGF1 组细胞增殖活力较 siMALAT1 组和空白组高(P0.05)。结论lncRNAMALAT1 可以促进人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,影响肺纤维化进程中 COL1、SMA 在肺组织中的沉积,靶向 lncRNA MALAT1 将有助于对肺纤维化过程的深入研究。关键词 长链非编码 RNA;肺腺癌转移相关转录本 1;特发性肺纤维化中图分类号 R563文献标识码 ADOI:10.12019/j.issn.16715144.2023.02
5、.008Effects of Long NonCoding RNA MALAT1 on the Transformation ofHuman Lung Fibroblasts Into MyofibroblastsCHANG Qing1,CHEN Fei1,ZHANG Tieshuan2,QIAO Hua1,WAN Junying3(1.Department of The First Pulmonary and Critical Care Medicine,Nanyang First Peoples Hospital,Henan Nanyang 473004,China;2.Departmen
6、t of Respiratory Medicine,The Second Affiliated Hospitalof Zhengzhou University,Zhengzhou 450014,China;3.Department of Pulmonary and Critical CareMedicine,Zhengzhou Zhongmu County Peoples Hospital,Zhengzhou 451450,China)Abstract:ObjectiveTo explore the effect of long noncoding RNA(lncRNA)metastasis
7、associated lungadenocarcinoma transcript 1(MALAT1)on the transformation of human lung fibroblasts into myofibroblasts.MethodsThe cultured human lung fibroblasts 1(HFL1)were divided into an observation group and a control group according to循证医学2023年第23卷第2期The Journal of EvidenceBased Medicine,2023,Vo
8、l.23,No.2103循证医学2023 年第23卷第2期whether they have the effect of transforming growth factor 1(TGF 1).Detected the expression levels of lncRNAMALAT1 in cells of the two groups.On this basis,four clusters were established:blank group,TGF 1 group,transfection control group,and siMALAT1 group.Cells in the b
9、lank group did not receive any treatment;the TGF1group was treated with TGF1 at 5 g/L;the transfection control group was treated with siMALAT1 negative control(NC)based on the TGF1 group;siMALAT1 group was treated with siMALAT1 based on the TGF1 group.The lncRNAMALAT1,mRNA expression levels of colla
10、gen 1(COL1)and smooth muscle activation protein(SMA),proteinexpression levels of COL1 and SMA,and cell proliferation were compared among them.ResultsCompared with thecontrol group,lncRNA MALAT1 relative expression in the observation group was higher(P0.05).There were statisticallysignificant differe
11、nces in the four groups on lncRNA MALAT1,mRNA expression levels of COL1 and SMA,and proteinexpression levels of COL1 and SMA(P0.05).The relative expression of RNA and protein above in the transfectioncontrol group and TGF1 group was higher than that in the siMALAT1 group and blank group(P0.05).The f
12、our groups showed significantdifferences in cell viability(P0.05).The proliferation activity of the transfection control group and TGF1 group washigher than that of the siMALAT1 group and blank group(P0.05).ConclusionsLncRNA MALAT1 can promote thetransformation of human lung fibroblasts into myofibr
13、oblasts,affecting the deposition of COL1,SMA in the lung tissueduring the course of pulmonary fibrosis,and targeting lncRNA MALAT1 would contribute to the indepth study of theprocess of pulmonary fibrosis.Key words:long noncoding RNA;metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1;idiopathic p
14、ulmonaryfibrosis特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种无法治愈的进展性肺部疾病,其发病率可随着年龄的增加而增加,且预后较差,给人们带来了沉重的经济和心理负担,而肺成纤维细胞增殖分化为肌成纤维细胞从而引起胶原等物质的沉积则是影响 IPF 发生的重要因素12。长链非编码 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA,曾经 被 认 为 是 无 用 的,而 近 年 来,人 们 认 为lncRNA 可以参与表观遗传学修饰、基因转录等多种生物学活动,从而在细胞的生长增殖过程中发
15、挥作用3。有研究表明,lncRNA 肺腺癌转 移 相 关 转 录 本 1(metastasis associated lungadenocarcinoma transcript 1,MALAT1)可以作为竞争性内源 RNA 影响微小 RNA 的表达,进而参与肝脏纤维化的发生4。其他的一些研究则表明,lncRNA MALAT1 还可以参与心肌以及其他部位的纤维化进程中5。然而,目前在我国有关lncRNA MALAT1 在肺纤维化中的研究尚为少见,而人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化则是IPF 发生的关键过程,因此,本研究就 lncRNAMALAT1 在人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞增殖分化中的作用以
16、及敲除该基因对此过程的影响进行了探索。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验仪器CO2细 胞 培 养 箱(美 国 Thermo ElectronCorporation 公 司),Eppendorf Mastercycler NexusGradient PCR 仪(德国 Eppendorf 公司),7500 RealTime PCR System(美国 Applied Biosystems 公司),FluorChem FC3 成像分析系统(美国 Proteinsimple公司)。1.1.2实验试剂本研究中的人胚肺成纤维细胞(human fetallung fibroblast 1,HFL1)购
17、自中国科学院细胞库,二 苯 基 四 氮 唑 溴 盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、蛋白提取试剂盒、SDSPAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱宝公司),胎牛血清(中国依科赛公司),胰 蛋 白 酶、DMEM 高 糖 培 养 液(BiologicalIndustries Israel Beit Haemek Ltd 公司),辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔 IgG、兔抗人型胶原(collagen 1,COL1)、平 滑 肌 肌动蛋白(smooth muscle activationprotein,SMA)、GAPD
18、H 抗体、siMALAT1(上海生工有限公司),TGF1(美国Sigma公司),转染试剂Lipofectamine 2000(美 国 Invitrogen 公 司),Page104Ruler Prestained Protein Ladder、RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit、PowerUp SYBR GreenMaster Mix(美国Thermo Scientific公司)。1.2实验方法1.2.1细胞培养DMEM高糖培养液中加入10%胎牛血清和1%青链霉素制真菌素配置成 HFL1 生长所用培养液,将细胞置于培养箱中培养,培养箱参数设定为:3
19、7、5%CO2。根据细胞生长情况定期更换培养液,应用含 0.02%EDTA 和 0.25%胰蛋白酶的胰蛋白酶溶液处理细胞从而进行传代。1.2.2转化生长因子1(transforming growth factor1,TGF 1)作 用 于 HFL 1 对 lncRNAMALAT1表达的影响将HFL1细胞分为观察组和对照组,观察组细胞采用5 g/L的TGF1作用48 h,对照组则不做处理,应用定量实时聚合酶链反应(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRTPCR)法就两组lncRNA MALAT1表达情况进行测定。qRTPCR法的具体过
20、程如下:移除培养皿中的培养液并用缓冲液冲洗2次,加TRIzol试剂,使细胞充分裂解后将其转移至EP管,室温孵育5 min后加氯仿,晃动EP管使溶液混匀,室温孵育2 min,离心(12 000 rcf,4,15 min),转移上清液,加入与其等量的异丙醇,室温孵育10 min,离心(12 000 rcf,4,10 min),移除上清液,加75%的乙醇,晃动后离心(7 500 rcf,4,5 min),移除液体后将 EP 管倒置风干。在EP管中加入适量无RNA酶水,依照说明书加入反转录试剂盒中各项试剂,依次进行反转录和 PCR扩增得到 CT 值,采用 2 CT法计算出两组细胞lncRNA MALA
21、T1的相对表达量。1.2.3实验分组上述实验结果表明,TGF1 处理后的 HFL1细胞中lncRNA MALAT1相对表达量较对照组高,在此前期实验的基础上,将细胞分为四组:空白组、TGF1组、转染对照组和siMALAT1组。空白组细胞不接受任何处理;TGF1组采用5 g/L的TGF1处理;转染对照组在 TGF1 组的基础上应用siMALAT1 阴性对照(negative control,NC)处理;siMALAT1组在TGF1组的基础上应用siMALAT1。1.2.4四组细胞lncRNA MALAT1、COL1和SMA的mRNA表达水平采用qRTPCR法就以上不同处理组别中细胞的lncRNA
22、 MALAT1、COL1和SMA的mRNA表达水平进行测定,实验步骤同上。1.2.5四组细胞COL1和SMA的蛋白表达水平采用 westernblot 法检测蛋白表达水平,实验过程如下:将完成各项处理的细胞制备成蛋白样品,并放置于-20 冰箱内保存。清洗玻璃板,并进行测漏,配分离胶,加入1 mL无水乙醇,0.5 h后倒掉无水乙醇,用吸水纸吸净残留的液体,配积层胶,并在玻璃板间插入梳子,待胶凝固将其安装于电泳槽中,电泳槽内加甘氨酸电泳缓冲液,拔除梳子,用加样枪上样后依次进行电泳和转膜,TBST清洗,5%的脱脂奶粉封闭1 h,再次应用TBST清洗,加入一抗,4 摇床过夜,TBST 清洗后加入二抗,
23、摇床孵育1 h,TBST清洗,加显影剂显影,观察所得到的图像资料,保存图像资料和数据。1.2.6四组细胞的增殖情况应用 MTT 法检测不同组别的细胞增殖情况。过程如下:将 HFL1 细胞消化后制成 1105/mL 的细胞悬液,并且在96孔板中每孔加入100 L,放入细胞培养箱中培养24 h,对细胞进行不同的处理后加MTT溶液,培养4 h之后弃上清,加入DMSO,摇床低速震荡 10 min,检测波长为 492 nm 时的不同组别的吸光度(absorbance,A)。1.3统计学方法用SPSS 17.0软件处理所获取数据,定量资料用均数 标准差表示,应用单因素方差分析以及KW秩和检验进行多组间数据
24、的比较,采用t检验对两组间数据进行比较,多组间数据的两两比较采用bonferroni法和LSDt检验,=0.05。2结果2.1TGF1作用于HFL1对lncRNA MALAT1表达的影响qRTPCR结果表明,经TGF1处理的观察组中lncRNA MALAT1相对表达量较对照组高,且差异具有统计学意义(t=6.249,P0.05)。2.2四组细胞 lncRNA MALAT1、COL1 和 SMA的mRNA表达水平空白组、TGF1组、转染对照组和siMALAT1组lncRNA MALA、SMA 和COL1的mRNA相对表达量有统计学差异(P0.05);其中,转染对照组和TGF1组以上RNA相对表达
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