针灸调控TNF-α_TLR4_NF-κB改善顺铂小鼠肝损伤的作用机制.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医针灸研究针灸调控TNF-/TLR4/NF-B改善顺铂小鼠肝损伤的作用机制王文哲1,魏星宇1,于冬冬1,2,杜雪源3,张晨1,王建明1,韩乐1(1.河南中医药大学针灸推拿学院 郑州 450046;2.河南中医药大学第三附属医院 郑州 450003;3.河南中医药大学中医学院 郑州 450046)摘要:目的通过观察针灸对顺铂(Cisplatin,DDP)所致肝损伤小鼠与肝细胞炎症反
2、应相关的肿瘤坏死因子-(TNF-)、Toll样受体4(TLR4)和核因子-B(NF-B)表达含量的变化,以及血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性变化,并结合小鼠肝脏病理变化,阐释针灸对DDP引起肝损伤小鼠的作用机制。方法选用SPF雄性KM小鼠,随机分为4组,按照10 mLkg-1空白组腹腔注射0.9%NaCl溶液,其余3组按照体质量腹腔注射同剂量DDP溶液,24 h后模型成功。干预组采用“大椎”“肝俞”“肾俞”“足三里”,分别给予针刺和艾灸干预,其余两组陪同固定不干预,每天1次,持续5天。断食1天后取材,生化检测血清中ALT、AST、GLDH含量,We
3、stern blot测定肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达含量。结果与空白组比,模型组血清中ALT、AST、GLDH活性增高,肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达升高,均有统计学意义(P0.05)。与模型组比,针刺组和艾灸组ALT、AST、GLDH活性和TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达均降低,均有统计学意义(P0.05),TLR4、NF-B 蛋白表达降低,有统计学意义(P0.05)。结论针灸可能通过抑制TNF-、TLR4的过度表达,从而降低NF-B过度表达,减少炎症因子的过度释放,从而减轻DDP小鼠肝脏炎症的发生,降低DDP对肝脏产生的毒副作用,对肝脏起到有效的保护作用。关键
4、词:针灸 顺铂 肝损伤 肿瘤坏死因子-Toll样受体4 核因子-Bdoi:10.11842/wst.20220829014 中图分类号:R245.3 文献标识码:A恶性肿瘤是临床病发率、病亡率较高的一种常见病。化 疗 仍 然 是 首 选 的 治 疗 方 式 之 一,顺 铂(Cisplatin,DDP)因其抗瘤谱较广而被广泛使用,但DDP在发挥高效抗肿瘤作用的同时,也对机体产生了严重的毒副作用1。有研究发现高剂量给药或低剂量重复给药都会造成肝损伤的发生2。而且目前尚无专门针对DDP造成肝损伤的特效药3,常规西药治疗虽然可以降低DDP造成的肝损伤,但是同时也会加重肝脏的药物代谢负担。课题组前期研究
5、结果表明:针灸可以清除自由基,增强肝脏组织抗氧化水平;提升外周血白细胞;调控肝脏中Caspase家族凋亡因子,改善细胞凋亡,降低化疗所致的多系统、多脏器的损伤4-7。本研究通过观察针灸对 DDP 肝损伤小鼠血清 ALT、AST、GLDH含量变化,以及肝脏中TNF-、TLR4、NF-收稿日期:2022-08-29 修回日期:2022-12-06 国家自然科学基金委员会青年基金项目(81804196):基于Notch信号通路及肝脏超微结构的针灸拮抗顺铂化疗小鼠肝损伤的机制研究,负责人:于冬冬;河南省科学技术厅河南省省级科技研发计划联合基金(优势学科培育类)(222301420077):基于JNK/
6、c-Jun凋亡通路针灸拮抗DDP肝损伤的机制研究,负责人:于冬冬;河南中医药大学博士科研启动项目(RSBSJJ2019-16):针灸拮抗CTX化疗所致骨髓损伤的作用机制,负责人:杜雪源。通讯作者:于冬冬,副教授,硕士研究生导师,博士,主要研究方向:针灸抗放化疗毒副作用及脏器损伤的研究。1055 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 B蛋白表达的变化,并结合肝脏病理,从炎症角度阐释针灸改善DDP
7、所致肝损伤的保护机制,为临床研究DDP导致肝损伤提供科学的实验室依据。1 材料和方法 1.1主要仪器毫针(规格0.1813 S,北京中研太和医疗器械有限公司)、实验用艾灸条(规格0.4 cm12 cm,临湘市湖香艾生物科技有限责任公司)、自制小鼠板、自制鼠夹子、钢尺、组织剪、止血钳、5 mL EP 管、冻存管、注射器、烧杯、肾型盘、滤纸、干冰、生理盐水、多聚甲醛、液氮、便签纸、自封袋、一次性医用手套、37恒温箱、-80冰箱、离心机、酶标仪、AST、ALT、GLDH试剂盒(南京建成科技有限公司)、TLR4、TNF-、NF-B蛋白试剂盒(BCA蛋白试剂盒,成都正能生物技术有限责任公司)等。1.2动
8、物及分组清洁级雄性KM小鼠40只,统一由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供SCXK(鲁)20190003,体质量(302)g,喂食3 d,适应实验室环境后,40只小鼠按照体质量随机分为4组,空白组、模型组、针刺组、艾灸组(实验室温度20-25,相对湿度60%左右)。用苦味酸进行小鼠染色编号。本实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会审核(DWLL2018030013),符合相关规定。1.3模型制备在无菌操作台上,用 10 mL 注射器抽取 10 mL 0.9%NaCl注射到顺铂瓶中(齐鲁制药有限公司,规格10 mg,批号:AA1A10078),充分溶解后获得1 mgmL-1的顺铂溶液。依据前期课题
9、组成熟的实验造模方法4-7,按照 0.01 mLg-1空白组小鼠腹腔注射 0.9%NaCl,模型组、针刺组、艾灸组根据体质量分别进行1次性腹腔注射造模,24 h后造模成功。1.4取穴及治疗方法小鼠穴位:依据 实验针灸学 教材腧穴定位取穴8,“大椎”在小鼠背部正中,第7颈椎与第1胸椎之间;“肝俞”在小鼠第九胸椎棘突下两旁肋间,左右各1穴;“肾俞”在小鼠第二腰椎棘突下两旁肋间,左右各1穴;“足三里”在小鼠后肢膝关节下外侧,腓骨小头下3.5 mm处,左右各1穴。空白组:每日依次根据编号抓取陪同固定6 min;模型组:每日依次根据编号抓取陪同固定6 min;针刺组:每日依次根据编号抓取固定,根据上述腧
10、穴用毫针针刺治疗,针刺3 mm,留针6 min,每天1次,持续5天;艾灸组:每日依次根据编号抓取,根据上述腧穴用实验用艾灸条治疗,距穴位皮肤约2 cm,每组穴悬灸3 min,大椎、肾俞归一组,肝俞、足三里归一组,共灸6 min,每天1次,持续5天。1.5取材各组小鼠第5天陪同固定及干预结束后,撤除饲料,正常饮水,24 h后称重取材。1.5.1血清各组小鼠按编号用冻存管依次眼球采血约1 mL,静止 2 h 后,放入离心机,3000 rmin-1,离心 10 min。离心结束,用移液枪取100 L上层清液,装入2 mL EP管中,按组编号置于-20冰箱中储存,备检。1.5.2肝脏各组小鼠在眼球取血
11、后,颈椎脱臼处死,置于干冰上快速解剖暴露肝脏整体,剪去左外侧叶,清除周围结缔组织,0.9%NaCl冲洗,滤纸吸取多余水分,装入 EP管,快速放入液氮中,按组编号放入-80冰箱中,备检。1.6检测依据试剂盒操作检测 AST、ALT、GLDH 含量;Western blot检测肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白相对表达量。取肝脏称重,通过清洗、超声粉碎、4裂解过夜、次日4,12377 rmin-1离心30 min、取上清进行组织蛋白提取;通过BCA蛋白浓度测定试剂盒,进行蛋白浓度测定;运用聚丙烯酰胺凝胶电泳;在进行转膜、封闭操作;孵育一抗、二抗;进行洗膜;通过ECL化学发光显影。检测肝脏组织中
12、TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达。1.7统计学方法采用SPSS 25.0统计分析软件进行数据分析。数据以均值标准差(x s)表示,各组数据符合正态分布,组间采用单因素方差分析,两两进一步采用 LSD 和Bonferroni 检验;以 P0.05 为差异具有统计学意义。采用GraphPad Prism 9绘图软件根据数据进行绘图。2 结果 2.1各组小鼠血清中ALT、AST、GLDH活性变化表1、图1结果所示,与空白组比,模型组小鼠血清中 ALT、AST、GLDH 明显升高,有统计学意义(P1056 Modernization of Traditional Chinese Medicine
13、and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医针灸研究0.05);与模型组比,针刺组、艾灸组小鼠血清中ALT、AST、GLDH明显降低,有统计学意义(P0.05)。2.2各组小鼠肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达变化图2、图3 Western blot结果示,与空白组比,模型组小鼠肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达显著升高,有统计学意义(P0.01);与模型组比,针刺组、艾灸组小鼠肝脏中 TNF-、TLR4、NF-B 明显下降,有统计学意义(P0.05),TLR4、NF-B显著下降,有统计学意义(P
14、0.05)。2.3各组小鼠肝脏HE染色病理结果观察400倍镜下显示:正常小鼠肝脏病理肝小叶清晰可见,细胞分布有序,胞质均匀致密,核呈椭圆状,未发现显著异常;而模型组小鼠肝脏可明显观察到汇管区附近出现细胞的聚集,出现大量点状坏死结构,细胞分布较为紊乱,细胞出现肿胀,胞质不再均匀致密,核发生变形,已经发生炎症反应第一阶段的细胞变性;针刺组和艾灸组汇管区可观察到少量坏死细胞,细胞分布较为整齐,胞质较为均匀致密,核恢复形态,损伤程度较轻(图4)。3 讨论化学药物治疗是当前医治恶性肿瘤的常用方式之一,肝脏是代谢的中心器官,在药物的代谢中起到表1各组小鼠血清中ALT、AST、GLDH活性(x s,n=6)
15、组别空白组模型组针刺组艾灸组ALT29.998.6052.307.52*30.574.0330.243.32#AST42.9710.2173.2310.34*58.8812.5357.9311.52#GLDH2.730.724.501.08*2.930.223.430.79#注:与空白组比,*P0.05;与模型组比,P0.05。ALTAST020406080100活力U/L空白组模型组针刺组艾灸组*#GLDH0246活力U/L空白组模型组针刺组艾灸组*#图1各组小鼠血清中ALT、AST、GLDH活性的比较注:与空白组比,*P0.05;与模型组比,P0.05。空白组模型组针刺组艾灸组TLR4TN
16、F-KDa 26NF-BKDa 120KDa 65图2各组小鼠肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白表达水平TNF-TLR4NF-kB蛋白相对表达量(%,-Actin)空白组模型组针刺组艾灸组*#*200250150100500图3各组小鼠肝脏中TNF-、TLR4、NF-B蛋白相对表达量比较注:与空白组比,*P0.01;与模型组比,P0.05;与针刺组比,P0.05。1057 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 V
17、ol.25 No.3 了关键性作用,因此正常肝细胞也可能受到细胞毒性化疗的影响9。化疗药物导致肝细胞产生毒副作用,造成细胞损伤、细胞炎症、甚至坏死等一系列肝损伤的表现10。化疗所致的肝损伤临床症状具有普遍性,如乏力、口渴、纳差等,以及肝区疼痛、腹胀、更甚者引起肝硬化、肝性肿瘤等。结合课题组前期30多年的研究,根据“扶正益肝”的原则,选取大椎、肝俞、肾俞、足三里作为医治DDP导致小鼠肝损伤的腧穴配伍。大椎可祛邪外出、激发阳气、恢复正气;肝俞可清利肝胆、疏理肝郁、散结止痛;肾俞可调补肾气、补益精髓、益肾养阳;足三里可生发胃气、健脾祛湿、补气生血、提升机体抵御外邪能力。诸穴合用可益肝健脾,培元固本,
18、补肾益气之功,可以改善化疗所致肝损伤,减少化疗所致不良反应,增加机体抗病能力。DDP是目前医治各种恶性肿瘤的最常用药物之一2。但在发挥高效抗肿瘤的同时,也有一些毒副作用,严重的如肝毒性、肾毒性和耳毒性等制约了其在临床的应用11。肝毒性是目前最严重的毒副作用之一,可能导致大量肝细胞坏死,进而导致肝衰竭。DDP进入肝脏后,肝脏的中性粒细胞和巨噬细胞渗漏增加,TNF-、NF-B 表达相较于对照组显著增加12。TNF-是一种重要的有多种生物活性的炎性因子,是巨噬细胞受到脂多糖刺激后而分泌的一种蛋白质,与其他炎性因子一起介导炎症反应13。TNF-可以促进IL-1、IL-6等因子渗出导致炎症的发生。TNF
19、-还能进一步增强中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等免疫系统细胞的活性加强炎症反应14。同时 TNF-也可促进激活NF-B因子,促使NF-B释放炎症因子,如TNF-、IL-1等介导炎症反应。TNF-作为炎性小体通路的始动因子,既可以直接促进炎症因子产生,又可以促进激活NF-B释放炎症因子,由此可知,TNF-在炎症反应中至关重要。研究显示,Toll 样受体 4(TLR4)通过促进 TNF-的释放,从而促进炎症因子的释放介导炎症反应14。TLR4是一种天然免疫受体,分布于巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等细胞中15。研究显示,TLR4 的激活与急性肝损伤密切相关16。TLR4作为关键性跨膜蛋白,可直接识别
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