新型2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响.pdf
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1、本文通过对已报道的具有优异杀虫活性的肟醚苯甲酰脲类化合物 NK-17 进行结构改造,得到化合物(E)-N-(4-(叔丁氧亚氨基)甲基)苯基)甲氨基甲酰基)-2,6-二氟苯甲酰胺(以下简称为“HN-21”),以改善其在有机溶剂中的溶解能力。采用叶片药膜法测定 HN-21 和对照药剂虱螨脲对草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda2 龄幼虫的生物活性,并分析其对草地贪夜蛾几丁质合成过程的影响。结果表明,HN-21 对草地贪夜蛾幼虫 72h 的致死中浓度为 0.681mg/L,显著低于虱螨脲(10.052mg/L),受试昆虫均死于蜕皮过程中。受试昆虫用虱螨脲 10.052mg/L处理
2、24h时,几丁质合成通路基因(sfTRE1、sfTRE2、sfGFAT、sfUAP、sfCHS1)表达量明显下降,早于用 HN-210.681mg/L 处理组,但 48h 时两组昆虫基因表达量下调程度已无显著性差异。该研究结果可为更好地开发利用苯甲酰脲类化合物提供理论依据。关键词:苯甲酰脲类化合物;草地贪夜蛾;生物活性;几丁质合成;基因表达量中图分类号:TQ450.1文献标志码:AEffects of a novel 2,6-difluorobenzoylurea compound on the bioactivity andchitin synthesis of Spodoptera fru
3、giperdaCHENJinpeng,XIEJia*,ZHAOKe,HUZhan,ZHANGXi,NANXiaohui,SUNRanfeng*(Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Agriculture and Forestry Biological Disasters Ministry of Education,School of Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China)Abstract:Inthispaper,structuralmodif
4、icationofbenzoylureacompoundNK-17,whichhasbeenreportedtohaveexcellentinsecticidalactivity,resultedinthecompound(E)-N-(4-(tert-butoxyimino)methyl)phenyl)(methyl)carbamoyl)-2,6-difluorobenzamide(hereinafterreferredtoasHN-21)toimproveitssolubilityinorganicsolvents.Theleaffilmmethodwasusedtodeterminethe
5、bioactivityoflufenuronandHN-21againstthesecondinstarlarvaeofSpodoptera frugiperda,andtheireffectsonthechitinsynthesisprocesswerealsoanalyzed.Theresultsshowedthatthemedianlethalconcentration(LC50)ofHN-21for72hwas0.681mg/L,significantlylowerthanthatofthepositive收稿日期:2023-02-20;录用日期:2023-05-11;网络首发日期:2
6、023-05-31.Received:February20,2023;Accepted:May11,2023;Published online:May31,2023.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0046http:/ KYQD(ZR)-21041.Funding:SupportedbytheHainanProvincialNaturalScienceFoundationofChina(No.321QN178,321CXTD436,321QN177)andtheScientificResearchStart-upFundPro
7、jectofHainanUniversityNo.KYQD(ZR)-21041.第一作者(Firstauthor):陈金鹏,.*通信作者(Correspondingauthors):谢佳,;孙然锋,.Theauthorsdeclarethattheyhavenocompetinginterests.农药学学报2023,25(4):798-807http:/Chinese Journal of Pesticide ScienceE-mail:controllufenuron(10.052mg/L),andalltheabnormallarvaediedduringmolting.Compared
8、tothecontrolgroup,theexpressionofchitinsynthesispathwaygenes(sfTRE1,sfTRE2,sfGFAT,sfUAP,sfCHS1)decreasedsignificantlyafter24hoflufenurontreatmentattheconcentrationof10.052mg/L,earlierthanHN-21treatmentattheconcentrationof0.681mg/L,buttherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroupsafter48htreatmen
9、t.Theseresultscanprovideatheoreticalbasisforthedevelopmentandutilizationofbenzoylureacompounds.Keywords:benzoylureacompounds;Spodoptera frugiperda;biologicalactivity;chitinsynthesis;geneexpression草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda 属于鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属,原产于南美洲与北美洲的南部与中部,于 2019 年 1 月首次从云南省侵入我国,其寄主范围广泛,同时还具有强大的迁飞能力和繁
10、殖能力,可致使农作物大幅度减产并造成难以估量的经济损失1。传统化学农药在对草地贪夜蛾的防治中仍占据重要地位,农业农村部推荐的用于草地贪夜蛾应急防治的化学农药单剂共有11 种,分别为:甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、茚虫威、四氯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、乙酰甲胺磷、虱螨脲和虫螨腈(http:/ 1。作为几丁质合成抑制剂,苯甲酰脲类杀虫剂因具有独特的作用机制、较高的环境安全性及对鳞翅目高效的杀虫活性等特点得到了广泛关注和应用及对此类化合物的结构改造一直是农药学研究的热点2。目前对苯甲酰脲类化合物的改造主要围绕苯甲酰基部分(A 环)、脲桥(C)和苯基部分(B 环)
11、3 部分进行3(图式 1),通过改造各部分的取代基,使其电子效应、空间位阻发生改变,从而影响杀虫活性4-6。多数研究表明,在 A 环部分,2,6-二氟取代优于 2,6-二氯取代,如 2,6-二氟苯甲酰脲的杀虫活性是 2,6-二氯苯甲酰脲的 20 倍;而苯甲酰环被芳香杂环或环烷基取代,其杀虫活性会降低7-9;在 B 环部分,2,6 位上有大分子基团不利于杀虫活性,4 位上有吸电子基团则有利于杀虫活性3。Wang 等报道了肟醚类苯甲酰脲类化合物 NK-17(图式 2)对鳞翅目害虫具有优异的杀虫活性10。为了提高其脂溶性以便于其更好地开发利用,本研究设计合成了化合物(E)-N-(4-(叔丁氧亚氨基)
12、甲基)苯基)甲氨基甲酰基)-2,6-二氟苯甲酰胺(HN-21),并评价了其对草地贪叶蛾幼虫的生物活性。目标化合物的设计见图式 2,合成路线见图式 3。另外,苯甲酰脲类化合物通过抑制昆虫体内几丁质的合成和沉积影响昆虫的生长发育过程已十分确定,处理受试昆虫后使其体内几丁质含量降低,在蜕皮过程中死亡3,11-13。对其候选分子靶标之一几丁质合成酶 1(chitinsynthase1,CHS1)的影响的研究显示,除虫脲对厩螫蝇Stomoxyscalcitrans蛹的 CHS 活力几乎没有影响14;而用0.5mg/L 除虫脲处理四斑按蚊Anopheles quadrima-culatus24h 后 CH
13、S1 的表达量显著升高15;用除虫脲、氟铃脲和氟苯脲处理鲑鱼虱LepeophtheirusNHNHNHNHOOFFOOClClOFFFFFFABC苯甲酰脲类化合物benzoylureas虱螨脲lufenuron图式 1 苯甲酰脲类化合物和虱螨脲的结构Scheme 1 Structures of benzoylurea compounds andlufenuronFFHNOHNON OFFHNONON O提高脂溶性Improve liposolubilityNK-17HN-21图式 2 化合物 HN-21 的设计Scheme 2 Design of compound HN-21No.4陈金鹏等:
14、新型 2,6-二氟苯甲酰脲类化合物对草地贪夜蛾的生物活性及其几丁质合成的影响799salmonis若虫后 CHS1 表达量却在中期微弱下调16。表明不同化合物对不同生物几丁质合成的影响存在差异,而不同活性的化合物对昆虫几丁质合成通路的影响差异却鲜有系统研究。因此,本研究以新型苯甲酰脲类化合物 HN-21 为例,探究其对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性,并从海藻糖含量、几丁质含量和基因表达量等多个层面与推荐用药虱螨脲对几丁质合成过程的影响进行比较,旨在阐明杀虫机理与杀虫活性之间的关联,为苯甲酰脲类化合物更好地开发利用提供理论依据。1 材料与方法 1.1 昆虫饲养供试草地贪夜蛾源自于海南大学植物保护学院,
15、饲养于海南大学植物保护学院生物测定中心。饲养环境条件为温度(271),相对湿度(705)%,光照周期为 16L:8D。幼虫饲喂改良的人工饲料17,成虫以 10%蜂蜜水喂养。1.2 主要试剂与仪器化学试剂均为分析纯,购自西陇化工有限公司;生物试剂,均购自上海碧云天生物科技有限公司;虱螨脲(lufenuron,有效成分含量 5%,剂型:乳油),购自欣丰农业科技有限公司。主要仪器:ABIQ5 型荧光定量 PCR 仪(美国赛默飞世尔科技公司);InfiniteM200PRO 型全波长酶标仪(瑞士 TECAN 公司);HC110-Pro 型金属浴(北京大龙兴创实验仪器股份公司);X-4 型数字显示显微熔
16、点仪(北京泰克仪器有限公司);BrukerAvance400型核磁共振分析仪(瑞士 Bruker 公司);质谱分析仪 Agilent6210ESI/TOFMS(美国安捷伦科技公司)。1.3 HN-21 的合成及溶解能力测定1.3.14-硝基苯甲醛肟(a)的合成参考文献 18的方法进行。在 250mL 三口烧瓶中加入 80mmol对硝基苯甲醛,加入 80mL 无水四氢呋喃使其溶解,再加入 96mmol 盐酸羟胺,用恒压滴液漏斗缓慢加入 88mmol 吡啶。滴加完毕,室温搅拌4h,薄层色谱(TLC,V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1)监测至原料反应完全。加水停止反应,用乙酸乙酯萃取。有机相依次用
17、 2%稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,滤液经旋转蒸发仪减压旋除溶剂后得黄色固体。用V(石油醚):V(乙酸乙酯)=(1020):1 混合溶剂重结晶得淡黄色针状晶体 a,收率为 90.5%。1.3.2(E)-O-叔丁基-4-硝基苯甲醛肟(b)的合成参考文献 18 的方法,在 250mL 三口瓶中加入19.2mmol 化合物 a,用 10mL 无水四氢呋喃溶解后加入 50mL 氯仿,升温至 5060,通入新制得的异丁烯气体,缓慢滴加 1.8mL 浓硫酸。滴加完毕,保持该温度反应,TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1)监测至原料反应完全。停止反应,冷却至室温,用水洗
18、涤 2 次,有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至中性,无水硫酸钠干燥。经柱层析(石油醚)分离出黄色固体 b,产率为 85.4%。1.3.3(E)-O-叔丁基-4-氨基苯甲醛肟(c)的合成参考文献 19 的方法,在 100mL 三口瓶中,加入 6.8mmol 化合物 b、30mL 乙醇和 5mL 水,O2NOHO2NNHOHO2NNHOH2NNHOHNNHOFFHNNNOOONH2OHHCl,PyTHF,rtFe/HClFFCONCOCH3ONaabcdHN-21Ethanol,60-70(CH2O)nCHCl3/THF,conc.H2SO4图式 3 化合物 HN-21 合成路线Scheme 3 Sy
19、nthetic route of compound HN-21800农药学学报Vol.25加热使其溶解,在 6070 下加入 1mL 浓盐酸,并分 4 批加入 23.8mmol 还原铁粉,每隔 20min 补加 50L 浓盐酸,使溶液保持酸性,TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1)检测至原料反应完全。停止加热,趁热过滤,用乙醇洗涤固体,滤液用氢氧化钠调节 pH 至 910,有深蓝色沉淀析出;再次过滤,滤液加水后用乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥。经柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1)分离,得红色液体 c,产率为 78.9%。1.3.4(E)-N-甲基-O-
20、叔丁基-4-氨基苯甲醛肟(d)的合成在 250mL 三口瓶中,加入 10.6mmol 化合物 c 和 70mL 无水甲醇,再加入 53mmol 甲醇钠,室温搅拌下加入 53mmol 多聚甲醛,加热回流 2h。冷却至室温,加入 53mmol 硼氢化钠,加热回流 2h,停止反应。冷却,旋转蒸发除去大部分甲醇,加入饱和碳酸氢钠溶液,用乙醚萃取3 次,合并有机相,用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,旋转蒸发除去溶剂,经柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)分离得到化合物 d,收率为 72.8%。1.3.5目标化合物 HN-21 的合成在 50mL 三口瓶中,加入 5.4mmol 化合物 d
21、 和 10mL 二氯甲烷,室温下用恒压滴液漏斗缓慢加入含有 5.6mmol2,6-二氟苯甲酰基异氰酸酯的二氯甲烷溶液。滴加完毕,室温搅拌 8h 至反应完全。先经柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1)分离,再用 V(石油醚):V(乙酸乙酯)=(1020):1 混合溶剂重结晶得到化合物 HN-21,收率为 73.1%。随后测定化合物 HN-21 溶解能力,并与 NK-17 的溶解能力作比较。1.4 生物活性测定采用叶片药膜法20测定化合物 HN-21 对于草地贪夜蛾 2 龄 1d 幼虫的杀虫活性。准确称量 5mgHN-21,用 1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解,得到 5000mg/
22、L 的 HN-21 母液,备用。用体积分数为 0.2的 DMF 水溶液将 HN-21母液稀释至 1.5、1.0、0.50、0.25、0.10mg/L,将合适大小的玉米叶片在药剂中浸泡 20s,取出晾干,置于培养皿中,并接入饥饿处理后的草地贪夜蛾幼虫 1 头,每处理组 20 头幼虫,每处理重复3 次。以无菌水为空白对照组,以 0.2DMF 水溶液为阴性对照组,以 10.052mg/L(经测定所得虱螨脲的致死中浓度(LC50值)的虱螨脲溶液为阳性对照组。每隔 12h 观察一次结果,用毛笔轻触试虫,试虫无反应视为死亡。所测数据用 IBMSPSSStatistics26 求得毒力回归方程,并计算LC5
23、0值。1.5 草地贪夜蛾幼虫总 RNA 的提取及 cDNA 的合成以无菌水为空白对照,以体积分数为 0.2的DMF 水溶液为阴性对照,分别以虱螨脲 0.681mg/L(化合物 HN-21LC50同等浓度)、虱螨脲 10.052mg/L作为阳性对照-1 组和阳性对照-2 组,以 HN-210.681mg/L(HN-21LC50)为待测药剂对草地贪夜蛾幼虫进行处理。分别取不同处理 0、24、48 和 72h 后的草地贪夜蛾幼虫(有表型且为存活状态),使用 Trizol试剂盒进行 RNA 的提取,以 3 只为一组,每处理重复 3 次。提取后用 1%的琼脂糖检测 RNA 质量,使用微量核酸测定仪Nan
24、oPhotometer测定提取RNA的浓度及纯度。使用试剂 HiScriptRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)进行cDNA第一链的合成。试验进行 3 次生物学重复。1.6 几丁质合成通路相关基因表达量的测定利用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析了不同处理组试虫体内与几丁质合成相关基因的表达水平19,包括:海藻糖酶 1(TRE1)、海藻糖酶 2(TRE2)、己糖激酶(hexokinase,HK)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,G6PI)、6-磷酸果糖转氨酶(fructose-6-phosphate transa
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