玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及m6A甲基化修饰相关基因表达的影响.pdf
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1、目的 本文旨在探究玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞的毒性作用 方法 用处理湖羊 通过法检测细胞增殖情况 和 分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化 结结果果 与对照组相比 处理组 活性和增殖数量极显著下降(.)细胞增殖相关基因 及其蛋白表达水平均极显著下降(.)促凋亡基因表达水平(、.、.)均显著升高相对应蛋白表达水平(、.)极显著升高抗凋亡基因 及蛋白表达水平显著降低(.)氧化应激相关基因相对表达水平(.、.)显著或极显著上升其相关蛋白表达水平(.)极显著上升 相关基因 的相对表达水平显著降低(.)和 水平极显著升高(.)水平显著升高(.)结结论论 可抑制湖羊
2、增殖促进湖羊 凋亡导致 发生氧化损伤产生毒性作用且其毒性作用可能跟 甲基化修饰相关关键词:玉米赤霉烯酮湖羊睾丸间质细胞增殖凋亡氧化应激 甲基化修饰中图分类号:.文献标志码:文章编号:()(.):()().(.).(.).(.)(.).(.).(.)(.).(.)(.)(.).:第 期刘亮等:玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及 甲基化修饰相关基因表达的影响玉米赤霉烯酮()是霉菌毒素之一是由镰刀菌属的真菌产生的次生有毒代谢产物对动物具有类雌激素样作用 对谷类作物的污染风险最高在动物饲料中的低水平污染非常普遍而这一霉菌毒素在很低的剂量下即可影响动物健康其中最严重的是产生生殖毒性影响生殖健康导致家畜
3、的生殖障碍 近年来的一些研究表明不同剂量的 在不同类型的细胞中具有不同的毒性机制 等的研究表明不同剂量 处理导致雄性异常精子数量显著增加活精子数量显著减少 雄性动物睾丸中的睾丸间质细胞()负责产生雄激素在雄性发育和生殖中起主要作用任何影响 功能和形态的毒素都可能导致生育能力不足或不育 因此 对雄性动物生殖系统包括对 的毒害作用已引起越来越多的关注甲基腺苷()是哺乳动物 最丰富的 修饰 已有研究表明 甲基化修饰在精子形成过程中起着重要作用其异常会使雄性生殖系统功能障碍 甲基化修饰动态调控在甲基转移酶()、甲基转移酶()、去甲基化酶 同系物()与 结合蛋白作用下完成 研究表明 的缺乏引起 水平升高
4、导致小鼠睾丸功能障碍精子发生异常和凋亡生育能力受损目前国内外在 对雄性动物生殖系统及功能的毒性作用研究大多是在猪或小鼠等单胃动物上开展而对反刍动物的影响研究报道不多特别是 对湖羊等反刍家畜的 增殖和凋亡的影响研究未见报道 的生殖毒性是否通过影响睾丸中 表观遗传修饰而产生仍未可知 因此为进一步探索 对雄性反刍动物的生殖系统的影响本试验以湖羊 为研究对象通过检测 对细胞的增殖、凋亡以及氧化应激的影响探讨 的生殖毒性并通过检测 甲基化修饰相关基因表达情况探讨 对湖羊 表观遗传修饰的影响为湖羊生产中进行 毒性防控提供理论基础 材料与方法.细胞试验所用湖羊睾丸间质细胞()从 月龄雄性湖羊阉割所得的睾丸组
5、织中分离获得所选湖羊健康、体况良好由启东瑞鹏牧业有限公司提供.主要试剂与材料玉米赤霉烯酮购自美国 公司胎牛血清和/培养基购自美国 公司 购自美国 公司细胞增殖检测()试剂盒购自江苏凯基生物公司 细胞检测试剂盒购自日本 公司反转录试剂盒购自南京诺维赞公司.细胞培养与试验分组用完全培养基(/含 胎牛血清青霉素链霉素混合液)培养 设置对照组(组加 )和 个试验组(分别加含、的.)每组设置 个重复 将所有细胞置于 、条件下培养 后检测细胞活性及凋亡相关基因 表达情况最终确定 试验浓度后进行试验.法检测细胞存活率用 完全培养基稀释 试剂至工作浓度 移除 孔板内试验处理后的培养基添加 工作浓度的 试剂溶液
6、 培养 在 处用微孔板读取器测量光密度值.法检测细胞增殖用完全培养基调整培养后的 密度以每孔 细胞接种于 孔板进行 标记 前期进行预试验确定加入 的浓度为 培养箱孵育 去除培养基后每孔加 中性多聚甲醛固定 去除固定液后每孔加入 甘氨酸溶液室温孵育(中和固定液)洗涤细胞(每孔 含 的 次)去除洗涤液后每孔加 .室温孵育 每孔加入 反应混合物室温避光孵育 每孔加入.溶液室温避光孵育 进行核染色 使用荧光显微镜检测并统计分析 阳性细胞比例.检测细胞增殖与凋亡、氧化应激及 甲基化修饰相关基因的表达使用 法提取 总 检测 均一性后使用反转录试剂盒进行反转录合成 每个基因设置 个重复以 为内参基因 引物序
7、列如表 所示 以反转录 为模板进行南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 反应体系():上、下游引物各.补加 .反应程序:预变性 变性 退火 个循环 采用 计算相关基因的相对表达水平表 引物序列 目的基因 引物对序列 ()产物长度/登录号 ./././././././././././././././.注:同系物 脱甲基酶基因 :甲基转移酶样 基因 :甲基转移酶样蛋白 基因 :包含区域 基因 :甲基腺苷 结合蛋白 基因 :增殖细胞核抗原基因 :相关 蛋白基因 :肿瘤蛋白 基因 :过氧化氢酶基因 :超氧化物歧化酶基因 :谷胱甘肽过氧化物酶基因 :肌动蛋白 基因 .检测细胞增殖、凋亡及氧化应激相关蛋白
8、表达用放射性免疫沉淀法使用蛋白裂解液 含苯甲基磺酰氟()和磷酸酶抑制剂各 和 提取 组湖羊 总蛋白 用 法检测蛋白浓度后在 、的条件下进行蛋白变性再在 恒定电压下进行 电泳 蛋白上样量 蛋白大小指示标记物()(变性后蛋白标准样品前、后都添加)用转膜仪 恒压转膜 用封闭液(脱脂奶粉)常温下封闭 封闭完成后用 溶液洗 次加一抗 下孵育过夜 洗 加二抗室温下孵育 洗 使用显影液孵育后显影拍照 使用 软件对条带进行灰度分析 试验所用抗体信息见表 表 抗体相关信息 抗体名称 货号 .来源 稀释比例 ()()().数据的处理及统计分析每个试验重复 次利用 .统计软件对试验数据进行单因素方差分析和差异显著性
9、检验所有结果均用平均数标准差表示 结果与分析.暴露对湖羊 活性及凋亡相关基因表达的影响如图 所示随着 浓度的升高湖羊 活性逐渐降低 与对照组()相比 处理的湖羊 活性极显著降低且最低(.)在 和 处理下 的 第 期刘亮等:玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及 甲基化修饰相关基因表达的影响 基因的相对表达水平与对照组相比显著下降(.)其中 处理 相对表达水平最低 处理时 基因的相对表达水平与对照组相比极显著上升(.)因此确定 进行后续试验图 玉米赤霉烯酮()暴露对间质细胞()活性及凋亡相关基因表达的影响 ()().:对照组 .下同 .图 ()处理对湖羊 增殖及相关基因和蛋白表达的影响 ().试验
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