无蹼壁虎EMC3基因cDNA全长克隆与进化分析.pdf
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1、为了探究无蹼壁虎(Gekko swinhonis)EMC3 基因(命名为 GsEMC3)的序列特征,了解 GsEMC3 蛋白的结构和功能,探讨 GsEMC3 蛋白与其他物种 EMC3 蛋白的进化关系,采用 SMART RACE 技术克隆获得了 GsEMC3 的全长 cDNA 序列,通过信息学分析阐明了 GsEMC3 基因的序列特征以及 GsEMC3 蛋白的结构和功能,系统发育和选择压力分析研究了 GsEMC3 的进化特征.GsEMC3 基因的 cDNA 全长为 1 023 bp,包含 1 个 786 bp 的开放阅读框,基因编码 1 个含 261 个氨基酸的多肽.GsEMC3 蛋白的相对分子质
2、量约为 30.074 103,理论等电点为 5.57.生物信息学分析表明,无蹼壁虎 GsEMC3 为疏水性非分泌型蛋白,有 2 个跨膜区,可能是一个动态定位的蛋白,无信号肽,直接在细胞内发挥作用.其分子量与已知的其他物种的 EMC3 蛋白相近.GsEMC3 蛋白含有 1 个DUF106 结构域,二级结构包含 12 个-螺旋、1 个-折叠、13 个无规则卷曲.系统发育分析表明,无蹼壁虎GsEMC3 蛋白序列与美国短吻鳄(Alligator mississippiensis)、安乐蜥(Anolis carolinensis)、绿海龟(Chelonia mydas)、科莫多巨蜥(Varanus ko
3、-modoensis)等爬行动物的 EMC3 蛋白序列高度同源.选择压力分析表明,无蹼壁虎的 GsEMC3 蛋白受到纯化选择,其功能可能高度保守.关键词:无蹼壁虎;GsEMC3 基因;cDNA;序列分析;选择压力中图分类号:Q71文献标志码:A文章编号:1671-1114(2023)03-0026-09收稿日期:2022-09-05基金项目:国家自然科学基金资助项目(31000954);江苏省高等学校自然科学研究重大项目(19KJA330001);江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX20_1241).第一作者:夏龙杰(1999),男,硕士研究生.通信作者:李鹏(1983),男,副教授,
4、主要从事动物生态与进化生物学方面的研究.E-mail:.第 43 卷第 3 期2023 年 5 月天 津 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)Journal of Tianjin Normal University(Natural Science Edition)Vol.43 No.3May 2023doi:10.19638/j.issn1671-1114.20230305第 43 卷第 3 期内质网是真核细胞最大的膜系统,在蛋白质的生物发生、脂质合成与储存、钙的储存与动态平衡等代谢反应中发挥核心作用1.在真核生物中,内质网负责分泌蛋白和膜蛋白的折叠与成熟,大多数完整的膜蛋白需要在内质
5、网中正确折叠,外界压力或突变会影响内质网折叠蛋白质的功能,导致糖尿病等疾病的发生2-3.内质网中完整膜蛋白的折叠需要分子伴侣和折叠酶,内质网膜蛋白复合体(endoplasmic reticulum membraneprotein complex,EMC)是内质网中蛋白质折叠所需的跨膜蛋白复合体,最先在酵母中被鉴定,酵母中 EMC亚基的丢失会导致膜蛋白不能正常折叠成二级结构,进而在内质网中积累,产生未折叠蛋白反应4.哺乳动物中有10个EMC成员,包括膜蛋白 EMC1、EMC3、EMC4、EMC5、EMC6、EMC7、EMC10 以及胞质蛋白 EMC2、EMC8 和 EMC95-6.内质网膜蛋白复
6、合体 3(EMC3)也称 TMEm111,是高度保守的内质网膜蛋白复合体EMC 蛋白的一个亚基.EMC3 蛋白对形态发生因子Wingless(Wg)的运输和信号转导有调节作用,在酵母和哺乳动物中首次发现 EMC 蛋白是维持内质网稳态所必需的7.EMC3 蛋白对于线虫的乙酰胆碱受体(AChRs)以及果蝇和斑马鱼的视紫红质等多种多通道跨膜蛋白的组装也必不可少8-11.总之,EMC3 蛋白参与了重要的细胞过程,在哺乳动物中已经被广泛研究12-14,在爬行动物中的研究则相对较少.无蹼壁虎(Gekko swinhonis)是我国特有的壁虎,分布于黄土高原、华北平原、黄淮平原和长江以北地区.以往对无蹼壁虎
7、的研究主要涉及形态学、生殖生态学、繁殖行为、同工酶电泳和壁虎属的系统发育15.在生物进化过程中,基因会受到环境的选择作用,受到正选择压力的基因可使个体或物种更具繁殖和生存上的优势,目前尚无相关研究探讨 EMC3 基因是否在爬行动物进化过程中发生适应性进化.近年来,用于检测选择压力的最大似然法检验被广泛接受,其中的选择系数 值,即非同义替换(nonsynonymous,dN)与同义替换(synonymous,dS)的比值,可直观反映基因序列在密码子水平上的进化趋势.对爬行动物EMC3 基因序列进行选择压力分析有利于了解该蛋白编码基因的适应性进化问题.本研究利用 RACE(rapidamplifi
8、cation of cDNA ends)技术克隆无蹼壁虎 EMC3基因全长 cDNA 序列(命名为 GsEMC3),运用生物信息学方法预测并分析 GsEMC3 蛋白的基本性质,下载加入近源 EMC3 基因序列,构建爬行动物 EMC3 基因树,并从进化生物学角度对 GsEMC3 进行选择压力分析.研究结果可为进一步探究该基因在无蹼壁虎中的生理机制提供参考,并为无蹼壁虎的基因多样性分析提供科学依据.1材料与方法1.1样品采集于南京野外捕获无蹼壁虎雄性成体一只,体长大于 60 mm,实验室饲养 2 周以上.将无蹼壁虎放入塑封袋后埋入碎冰块中麻醉,在超净工作台中快速取肌肉和性腺组织各 2 mg,装入
9、1.5 mL 离心管(预装 1.0mL的 RNAlaterRNAStabilizationReagent,购自德国Qiagen公司),并用无 RNAse 的手术剪剪碎成 1 mm 以下颗粒物,放入-20 冰箱中保存备用.1.2方法1.2.1总 RNA 提取与 cDNA 合成实验所需引物及序列如表 1 所示.按照 Trizol 试剂(日本 TaKaRa 公司)说明书提取总 RNA,用 ThermoNanoDrop2000/2000C(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)分光光度计和 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的质量和纯度,使用反转录试剂盒 PrimeScrip
10、tTMRTMaster Mix(日本 TaKaRa 公司)对无蹼壁虎的总 RNA进行反转录得到 cDNA 第一链,使用 RNase Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司)对合成的 cDNA 进行去 RNA 处理.1.2.2GsEMC3 基因表达序列标签序列的获取基于本实验室前期已建立的无蹼壁虎性腺抑制性消减杂交 cDNA 文库(数据尚未公布)获取 GsEMC3基因的表达序列标签(expressed sequence tags,EST)片段,用于特异引物设计,进行 GsEMC3 基因全长cDNA 片段的克隆.1.2.3GsEMC3 基因全长 cDNA 的克隆基于已经验证的 GsEMC3 基因
11、 EST 序列,设计引物名称用途序列(5-3)R663-1(GSP1)5RACE GCAACTCAATCCCCTGR663-2(GSP2)5RACE GCAGTGTCAAAGGAAAAGGGR663-3(GSP3)5RACE TGTAACAAAACCTGAGAAAGTC3390-13RACE ACTGAATGGGAGGCTTTGGAGTTGAC3390-23RACE GGCTAAAGACCTCCGCTTTGAAGGCAAAPPCRGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIGAUAPPCRGGCCACGCGTCGACTAGTACQC663FORFGAATTATATTT
12、AAACCATGAGTGQC663RORFCACCAGCTAGCTAAACCAGC表 1实验所用的引物序列Tab.1Primers sequences used in the experiment夏龙杰,等:无蹼壁虎 EMC3 基因 cDNA 全长克隆与进化分析27天 津 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)2023 年 5 月3RACE 和 5RACE 的特异性引物以及巢式 PCR 反应的特异性引物,使用用于 cDNA 末端快速扩增的 5RACE 系统(美国 Invitrogen 公司)试剂盒获得该基因的 5端序列后,用 DNA 纯化系统(美国 Promega公司)对经 RNAase
13、 处理过的 cDNA 进行纯化.使混合液平衡至室温,对于每个要纯化的样品用 65 的灭菌蒸馏水配平至 100 L,将 120 L 混合液(6 mol/LNaI)加入第一条链的反应中,将 cDNA/NaI 溶液转移到离心管中.13 000 r/min 下离心 20 s,从管中取出盒芯,将流出的液体转移到一个离心管中,保存该溶液直到确认 cDNA 的回收.将滤芯放回管中,在低温(4)条件下将 0.4 mL 洗涤缓冲液加入到离心管中,13 000 r/min下离心 20 s,丢弃流出的液体.再重复这个洗涤步骤 3次,用 400 L 低温(4)的 70%乙醇洗脱 2 次,最后从管中取出乙醇清洗液后,1
14、3 000 r/min 下离心 1 min.将滤芯转移到一个新的离心管中,将 50 L 灭菌过的蒸馏水(预热至 65)加入到滤芯中,13 000 r/min 下离心 20 s,洗脱 cDNA.使用 TdT 酶(日本 TaKaRa 公司)和 dCTP(生工生物工程(上海)股份有限公司)对纯化后的 cDNA 进行末端添加多聚 C.在每个管中加入以下组分并轻轻混合:6.5 L DEPC 处理水,5.0 L 5 tailing buffer,2.5 L2 mmol/L dCTP,10.0 L GLASSMAX 纯化 cDNA 样本,最终体积为 24.0L.在以下反应体系中进行:94下孵育 23 min
15、,在冰上冷却 1 min.通过短暂离心收集管中的内容物并置于冰上,加入 1 L TdT 轻轻混匀,在 37 下孵育 10 min,65 条件下加热灭活 TdT10 min,短暂离心后收集反应物并置于冰上.使用引物 GSP-2 和试剂盒里的桥连铆钉引物AAP对已经加 dC 尾的 cDNA 进行 PCR 第 1 轮扩增.具体操作:在冰上放置的 0.2 mL 或 0.5 mL PCR 管中加入31.5L 灭菌蒸馏水、5.0L10PCRbuffer(200mmol/LTris-HCl,pH 值为 8.4,500mmol/L KCl)、3.0 L 25 mmolMgCl2、1.0 L 10 mmol/L
16、 dNTP mix、2.0 L nested GSP2、2.0 L 桥连铆钉引物(10 mol/L)、5.0 L dC-tailedcDNA,最终体积为 49.5 L.混匀前加入 0.5 L TaqDNA 聚合酶,混匀后覆盖 50100 L 的矿物油.将离心管直接从冰上转移到 PCR 仪(预平衡至初始变性温度为 94)上,进行 3035 个循环的 PCR.对于扩增区域小于 1 kb 的 cDNA,循环方案为:94,准备 12 min,94 变性 0.51.0 min,55 引物退火 0.51.0 min,72 引物延伸 12 min,72 最终延伸 57 min,保持 5 后取出.使用引物 G
17、SP-3 和试剂盒原有的桥连通用扩增引物 AUAP 进行巢式 PCR 第 2 轮扩增:将第 1 次PCR的 5 L 产物稀释到 495 L 的 TE 缓冲液(10 mmol/LTris-HCl,pH 值为 8.0,1 mmol/L EDTA)中,将 PCR仪预热到 94.在冰上放置的 0.2 mL 或 0.5 mL PCR 管中加入以下组分:33.5L 灭菌蒸馏水、5.0 L 10 PCRbuffer(200 mmol/L Tris-HCl,pH 值为 8.4,500 mmol/LKCl)、3.0 L 25 mmol/L MgCl2、1.0 L 10 mmol/L dNTPmix、1.0Lne
18、stedGSP、1.0LAUAP或UAP(10mol/L),5.0L稀释后的 PCR 第 1 轮产物,最终体积为49.5 L.混匀前加入 0.5 L Taq DNA 聚合酶,混匀后覆盖 50100 L 矿物油.纯化后的 PCR 产物与 pMD18T 载体(日本 TaKaRa 公司)进行连接,转化后取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序.使用Clontech 公司的 SMARTerTMRACE cDNA Amplifica-tion Kit 试剂盒,获得该基因的 3端序列,使用逆转录酶 SMARTScribeTMReverse Transcriptase(生工生物工程(上海)股份有
19、限公司)和引物 3CDS primer A 对总RNA 进行逆转录合成 cDNA.使用引物 3390-1 和UPM,以上面合成的 cDNA 为模板进行第 1 轮 PCR扩增.将第 1 轮 PCR 扩增产物稀释 50 倍,然后用引物 3390-2 和 UPM 进行第 2 轮 PCR 扩增.将第 2 轮PCR 产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化,纯化后的 PCR 产物与 pMD18T 载体进行连接,转化后挑取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,最后将测序所获得的目的基因片段进行全长拼接及 ORF 预测,将测序所得序列在美国国立生物技术信息中心(National Center
20、for Biotechnology In-formation,NCBI)应用 Blast 工具进行比对和验证.1.2.4RACE PCR 序列验证为验证 RACEPCR 扩增的序列是否正确,以EST序列验证时的 cDNA 为模板,使用高保真酶,QC663F/QC663R 为引物进行 PCR 扩增,反应结束后取 PCR产物于 1%的琼脂糖凝胶上电泳检测.根据检测结果确定使用 PCR 产物直接纯化还是凝胶回收(使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 切胶回收PCR 产物),用 QC663F/QC663R 对 PCR 产物进行测序.测序由生
21、工生物工程(上海)股份有限公司完成.1.3生物信息学分析利用NCBI的Blast工具验证GsEMC3基因的cDNA全长;用 ORFFinder 查找 GsEMC3 基因的开放阅读框;利用在线服务器 ExPASy(https:/web.expasy.org/)的 Prot-Param 工具16分析 GsEMC3 蛋白相关的基本性质;利用在线软件 MotifScan(https:/myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)搜索 GsEMC3 蛋白的 motif.分别用28第 43 卷第 3 期表 2用于适应性进化分析的各物种 EMC3 基因序列号Tab.2Sequen
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