小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较.pdf
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1、第 35 卷 第 3 期2023 年 9 月塔里木大学学报Journal of Tarim UniversityVol.35 No.3Sep.2023文章编号:1009-0568(2023)03-0012-06收稿日期:2022-11-14基金项目:国家自然科学基金项目“创伤微环境 HGFc-Met 信号对鹿茸间充质干细胞增殖、迁移与分化的调控机制”(31860629)第一作者:张荠允(1998-),女,2020 级在读硕士研究生,研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail:通信作者:韩春梅(1968-),女,博士,教授,研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail:小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细
2、胞基本生物学特征比较张荠允1,方翟2,贾小东1,刘嘉伟1,侯正创1,韩春梅1,3(1 塔里木大学动物科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)(2 塔里木大学生命科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木畜牧科技兵团重点实验室,新疆 阿拉尔 843300)摘要 为研究塔里木马鹿茸间充质干细胞(MSCs)的生物学特征,本试验对来源于小鼠骨髓和塔里木马鹿茸的 2 种 MSCs 进行了体外培养,检测比较了其生长曲线;同时利用光学显微镜和透射电镜对细胞形态特征、结构、细胞器组成和数量进行观察对比。研究发现鹿茸 MSCs 体外培养呈“S”形生长趋势,增殖速度极显著高于小鼠 BMSCs(P
3、0.01)。鹿茸 MSCs 形态呈梭形,排列规律,形态均一;小鼠 BMSCs 形态不规则,呈三角形,多边形;鹿茸 MSCs 胞体、胞核面积分别为 963.053 m2和134.093 m2,极显著高于小鼠 BMSCs 的 551.026 m2和 79.938 m2(P0.01);鹿茸 MSCs 的核质比为 0.167,显著低于小鼠BMSCs 的 0.206(P0.05);超微结果显示鹿茸 MSCs 胞体面积较大,细胞器种类简单,线粒体、内质网等细胞器形态具备早期幼稚细胞发育特征。塔里木马鹿茸 MSCs 增殖能力高于小鼠 BMSCs,在开发利用方面具备更广泛的优势。关键词 塔里木马鹿茸;间充质干
4、细胞(MSCs);生物学特性;超微结构中图分类号:Q952文献标识码:ADOI:10.3969j.issn.1009-0568.2023.03.002Comparison of biological characteristics of mouse bone marrow with deer antler mesenchymal stem cellsZHANG Jiyun1,FANG Di2,JIA Xiaodong1,LIU Jiawei1,HOU Zhengchuang1,HAN Chunmei1,3(1 College of Animal Science and Technology,T
5、arim University,Alar,Xinjiang 843300)(2 College of Life Science and Technology,Tarim University,Alar,Xinjiang 843300)(3 Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production&Construction Corps.Alar,Xinjiang 843300)Abstract The objective was to study the biological chara
6、cteristics of Tarim Red Deer antler mesenchymal stem cells(MSCs).Two types of MSCs from mouse bone marrow and Tarim Red Deer antler were cultured in vitro and their growth curves were examined and compared.The morphological features,structure,organelle composition and number of cells were also obser
7、ved and compared using light 第 3 期张荠允 等:小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较13 microscopy and transmission electron microscopy.The results showed that the growth trend of deer antler MSCs was“S”shaped,and the proliferation rate was significantly higher than that of mouse BMSCs(P0.01).The morphology of deer antl
8、er MSCs were shuttle-shaped,regularly arranged and homogeneous,while that of mouse BMSCs was irregular,triangularand polygonal.The cytosolic and nucleolar areas of deer antler MSCs were 963.053 m2 and 134.093 m2,respectively,which were significantly higher than those of mouse BMSCs at 551.026 m2 and
9、 79.938 m2(P0.01).The nucleoplasmic ratio of deer antler MSCs was 0.167,which was significantly lower than that of mouse BMSCs at 0.206(P0.05).The ultramicroscopic results showed that deer antler MSCs had a large cytosolic area,simple organelle types,and organelle morphology such as mitochondria and
10、 endoplasmic reticulum with early naive cell development characteristics.The proliferative capacity of Tarim Red Deer antler MSCs was higher than that of mice,and it has wider advantages in exploitation.Keywords Tarim Red Deer antler;mesenchymal stem cells(MSCs);biological characteristics;ultrastruc
11、ture 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类能够进行自我更新及多向分化且具有低免疫原性的细胞,被广泛应用于细胞治疗、免疫调节、组织工程等多个领域1,是再生医学中充足的干细胞来源,也是组织工程学中重要的后备材料。目前,骨髓、脐带、脂肪等组织来源的 MSCs 在临床治疗上的使用已经获得了初步的疗效2-4。鹿茸的生长与再生基于干细胞的增殖分化5,与传统的 MSCs 相比,鹿茸间充质干细胞是一类具有胚胎干细胞部分特性的成体干细胞,具有软骨、骨、脂肪等多向分化潜能,而且鹿茸 MSCs 来源广泛、丰富,且不伤害动物机体,是一类具有广阔应用前景的干细胞。现已有运用鹿
12、茸 MSCs 治疗小鼠放射性皮肤损伤修复的研究报道6-7;鹿茸 MSCs 在减轻肝纤维化中也具备一定疗效,能作为治疗肝纤维化等疾病的新型细胞来源8。细胞超显微结构的研究有助于了解细胞的状态和功能,也为细胞形态学提供重要理论基础9。LI C 等10在 1998 年对鹿茸角柄发生和初鹿角形成等 5 个发育阶段的鹿茸干细胞超微结构做了研究,初步发现了鹿茸干细胞 ASCs(antlerogenic periosteal cells)与胚胎干细胞相似的特征,细胞内均富含糖原,内质网不发达,但由于取样等因素未进行进一步深入全面的研究。鹿茸组织中存在的生茸骨膜干细胞 APCs(antlerogenic pe
13、riosteal cells)、角柄骨膜干细胞 PPCs(pedicle periosteum cells)、增生的间充质干细胞都被定义为干细胞,但鹿茸间质层的 MSCs 是鹿茸顶端增生组织间质层的细胞,容易获取而且不会对鹿造成任何损伤,是具有广阔前景的一类新型干细胞。研究鹿茸 MSCs 的细胞生物学特性对其开发利用有重要的意义。本研究以小鼠骨髓间充质干细胞为对照,研究利于体外培养鹿茸 MSCs 的生长规律;采用生物透射电子显微镜对鹿茸 MSCs 超微结构进行研究,获得鹿茸 MSCs 基本生物学特征,为鹿茸 MSCs 应用提供理论支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 鹿茸 MSCs 和小
14、鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对马鹿麻醉处理,锯取鹿茸,用去污粉清洗茸表面污物,酒精棉擦拭后于超净工作台切取鹿角顶部约 5 cm 鹿茸组织,纵向剖开,分离间充质组织;配制含 PS 量为 800 IU、400 IU、200 IU 的 3 种浓度的D-Hanks 液,将分离所得组织放入不同浓度 D-Hanks液冲洗 3 遍;冲洗后剪成 0.5 mm0.5 mm 的组织块,移入离心管中,加入 0.25%胰蛋白酶,37 消化1 h,弃去胰酶;加入 0.1%型胶原酶,培养箱中消化 5 h;上清液移至离心管,1 000 rmin 离心 5 min,弃上清,加入 1 mL 培养液进行细胞计数,按照 105
15、 个mL 浓度接种,隔 2 d 换液,细胞生长至 80%90%进行传代,传至第 3 代性状稳定后取生长对数期细胞使用。颈椎脱臼法处理 3 周龄昆明小鼠,于 75%酒精中浸泡 3 次,5 min次;无菌条件下剥离双侧股骨,PBS 清洗股骨;完全培养基冲洗骨髓腔,冲洗液收集于离心管中,1 000 rmin 离心 5 min 后弃上清;用完14 塔里木大学学报第 35 卷全培养基重悬细胞沉淀,血细胞计数板进行细胞计数,调整细胞密度为 105 个mL,接种于培养瓶进行细胞培养;细胞生长至 80%90%传代,用全骨髓贴壁法进行细胞传代培养,传至第 3 代性状稳定后取生长对数期细胞使用。1.1.2 试剂与
16、仪器 光学显微镜(NiKon)、生物透射电子显微镜(HITACHI H-7650)、台式高速冷冻离心机(Sigma 3K30)、涡旋振荡器(Scientific Industries SI Vortex-Genie 22 T)、-80 超低温冰箱(美国赛默飞世尔科技公司)、酶联免疫检测仪、掌上型离心机(赛伯乐仪器有限公司)、超薄切片机(Leica)、完全培养基(DMEM+10%FBS+PS)、胎牛血清(FBS,Gibco)、双抗(penicillin-sreptomycin,PS)、磷 酸 盐 缓 冲 溶 液(PBS)、CCK8 溶液(Solarbio)、胰酶、2.5%戊二醛固定液、6 种浓度
17、乙醇溶液(30%,50%,70%,80%,90%和 95%)、无水乙醇、丙酮、包埋剂、柠檬酸铅溶液、醋酸双氧铀。1.2 方法 1.2.1 光学显微镜下观察 MSCs 取对数期鹿茸 MSCs(P3)、小鼠 BMSCs(P3)接种于 6 孔板制作细胞爬片,观察细胞贴壁后,PBS 清洗;4%多聚甲醛固定 10 min,PBS 清洗 3 5 次;0.1%TritonX-100 溶液透化细胞 15 min;苏木素染色 40 min,蒸馏水冲洗;伊红染色 11 min,蒸馏水冲洗后进行观察拍照。根据 HE 染色结果,每个爬片取 5 个视野,利用 IMAGE J 软件统计每个视野(200)下的细胞数,测量每
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