探究GIRK蛋白与小鼠三叉神经痛中疼痛行为的相关性.pdf
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1、(Biomedical Transformation),2023年9月,第4卷,第3期探究GIRK蛋白与小鼠三叉神经痛中疼痛行为的相关性潘旭强1,韩靓2,石铁军2*收稿日期:2023-09-04;修回日期:2023-09-15通信作者:石铁军(1969-),男,黑龙江哈尔滨人,硕士生导师,主要从事初级感觉神经元的神经可塑性机制研究。E-mail:D【摘要】目的 三叉神经痛是最常见的颌面疼痛综合征,其病因尚未完全明确。本文主要研究G蛋白门控内向整流钾离子通道(G Protein-gated Inwardly Rectifying Potassium Channel,GIRK)蛋白在三叉神经痛中的
2、作用及表达情况,为三叉神经痛的治疗提供新方向。方法 通过眶下神经横断手术建立小鼠的三叉神经痛动物模型,利用Von Frey测量其机械性异常性疼痛;记录其面部抓挠次数来测量其自发痛;使用Western Blot检测三叉神经节中GIRK蛋白的表达情况。结果 研究发现,小鼠三叉神经损伤后,与对照组相比,其机械性异常性疼痛和自发痛在术后3-21天均有显著性增强,而三叉神经节中GIRK1-3蛋白水平均下调。结论 本研究成功建立了小鼠的三叉神经痛模型,表明GIRK可能在神经损伤后的三叉神经痛中发挥重要作用。【关键词】三叉神经痛;G蛋白门控内向整流钾离子通道;机械性异常性疼痛;自发痛中图分类号:R745.1
3、+1文献标识码:A文章编号:2096-8965(2023)03-0080-06Exploring the correlation between GIRK proteins and painbehavior in trigeminal neuralgia in micePan Xuqiang1,Han Liang2,Shi Tiejun2*(1.Ningbo No.2 Hospital,Ningbo 315010,Zhejiang,China;2.School/Hospital of Stomatology,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)【Ab
4、stract】Objective Trigeminal neuralgia is the most common maxillofacial pain syndrome,and itsetiology has not been fully understood.In this paper,we focus on the role and expression of G protein-gatedinwardly rectifying potassium channel(GIRK)protein in trigeminal neuralgia to provide a new direction
5、 for thetreatment of trigeminal neuralgia.Methods An animal model of trigeminal neuralgia in mice was established byinfraorbital nerve transection surgery,and its mechanical abnormal pain was measured by using Von Frey;thenumber of facial scratches was recorded to measure its spontaneous pain;the ex
6、pression of GIRK protein intrigeminal ganglion was detected by Western Blot.Results Our research discovered that after trigeminal nerveinjury in mice,both mechanical abnormal pain and spontaneous pain were significantly enhanced at 3-21 dayspostoperatively compared to controls,while both GIRK1-3 pro
7、tein levels were downregulated in the trigeminal(1.宁波市第二医院,浙江 宁波 315010;2.兰州大学口腔医学院,甘肃 兰州 730000)DOI:10.12287/j.issn.2096-8965.20230312 论著 80(Biomedical Transformation),2023年9月,第4卷,第3期ganglion.Conclusion Trigeminal neuralgia model in mice was successfully established,and suggesting thatGIRK may play
8、 a significant role in trigeminal neuralgia after nerve injury.【Keywords】Trigeminal neuralgia;G protein-gated inwardly rectifying potassium channel;Mechanical abnormalpain;Spontaneous pain疼痛是一种与实际的或潜在的组织损伤相关的,不愉快的感官和情感体验。根据持续时间的长短可分为急性疼痛和慢性疼痛。一般认为疼痛时间持续或复发超过3个月为慢性疼痛1。在慢性疼痛中,三叉神经痛长期以来是世界范围内较为常见,且严重影响
9、人们健康和生活质量的疾病之一,在男性和女性中的发生率分别为每年2.5/10万和5.7/10万2。三叉神经痛实际是一种以电击样疼痛为特征、反复发作的疾病。一般局限在单侧三叉神经支配区域内,有一个或者多个“扳机点”。轻触或刺激“扳机点”可激发疼痛发作,即使是无害刺激也可引发疼痛。随着时间推移和病情进展,疼痛发作时间越来越长,发作间隔越来越短3。但在疼痛发作之后,通常会有一个“不应期”,在此期间刺激“扳机点”疼痛不会被触发。当疼痛剧烈时,患者面部肌肉可呈痉挛状,皱眉咬牙,或用手掌揉搓疼痛部位,也可有其他轻微的自主神经症状,比如流泪或者眼睛发红等。除“扳机点”现象外,患者三叉神经面部区域常无其他异常体
10、征,少数可能伴有面部感觉减退或者痛觉过敏。三叉神经痛的治疗包括药物、手术和辅助方法。抗惊厥药和三环类抗抑郁药等药物是主要的药物选择,卡马西平则是三叉神经痛的一线治疗药物。同时,手术治疗(三叉神经撕脱术、射频消融术等)及保守治疗也是有效的方法。到目前为止,由于对三叉神经痛的发病机制缺乏足够的了解,该疾病的治疗方法仍然非常有限4-6。G 蛋白门控内向整流钾离子通道(G Protein-gatedInwardlyRectifyingPotassiumChannel,GIRK)是神经元细胞兴奋性调节相关的重要因子之一,在药理学和动物模型研究中,其在疼痛感知和记忆调节等领域发挥着重要作用7,8。作为 G
11、蛋白介导的信号通路的重要下游抑制因子,GIRK同时也与癫痫、心律失常、帕金森症、药物成瘾等多种人类疾病相关,可作为药物治疗的重要靶点之一,具有较好的医疗潜力以及改善相关靶向治疗药物的可能性9,10。本研究拟通过建立小鼠的三叉神经痛动物模型,分析其GIRK1-3蛋白的表达,探究三叉神经痛与为治疗三叉神经痛提供新的思路。1材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物在本实验中采用的动物为兰州大学动物实验中心的昆明小鼠。选取6-8周的成年雄性小鼠,在清洁级条件下进行饲养。鼠房采用12 h光照/黑暗循环(从800到2000开灯),每笼饲养46只,小鼠可自由获取食物和水。所有实验动物均已通过兰州大学口腔医
12、学院伦理委员会的批准(审查编号:LZUKQ-2022-047)。1.1.2 试剂与仪器Von Frey纤维丝(上海玉研仪器有限公司);水合氯醛(美国Thermo Fisher公司);TDZ4-WS台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);RT-6100酶标仪(美国Rayto公司);D3024R台式高速冷冻离心机(北京DRAGONLAB);KZ-F研磨仪、DS-2S100脱色摇床(钟摆型)、SVE-2垂直电泳仪、SVT-2 转印电泳仪、SPW-6S 电泳电源、G9055-4抗体孵育盒、RIPA裂解液、50Cocktail蛋白酶抑制剂、PMSF(100 mM)、5蛋白还原型上样缓冲液、SD
13、S-PAGE凝胶制备试剂盒、PVDF膜0.45m、ECL化学发光试剂盒、TBS缓冲液(武汉Servicebio 公司);SPR80 制冰机(中国 SIMAG公司)。1.2 三叉神经痛动物模型的建立本实验中采用的手术方式为小鼠进行眶下神经部分横断术,以达到建立三叉神经痛动物模型的目的。被选用的小鼠的体重为(1822)g。使用 24只小鼠进行实验,分成 2 组,手术组和对照组各12只。使用4水合氯醛(0.1 mL/10 g)通过腹腔注射麻醉小鼠之后,固定小鼠为仰卧位,通过手术线打开小鼠口腔。使用锋利的镊子或者较细的针头在小鼠口腔右侧腭部黏膜处纵行打开一条约为(22.5)mm的切口。切开后,使用眼科
14、镊钝性分离组织,通过该切口暴露眶下神经。暴露眶下神经主干81(Biomedical Transformation),2023年9月,第4卷,第3期后,剪断并剪除1 mm神经组织以防止再生。将黏膜拉拢,无需做缝合及其他额外处理。术后将小鼠转移至温暖处,待其苏醒后每只转移至独立的鼠笼中,防止其因疼痛产生不适而发生争斗。对照组小鼠也在同样的手术位置划开相同长度伤口,但不对神经进行处理,其余处理同手术组小鼠。1.3 动物行为学相关测试1.3.1 机械性异常性疼痛测试通过Von Frey细丝刺激小鼠触须垫的方式来确定其机械性异常性疼痛。实验中,我们借鉴了之前的研究11方法,设计了一个方盒子(888)cm
15、来作为测试场所。该盒子的五面均用不透光的材料盖上,只留观察的一面透光,而在观察面的最底部与盒子底部之间有着0.5 mm的缝隙,这个缝隙可供小鼠的吻部探出,并能够阻止小鼠通过缝隙逃出盒子。在术后的1周内,每隔1天对小鼠进行1次测试,在术后第10、14、21、28天时分别对小鼠进行机械性异常性疼痛测试。每次测试前需让小鼠在环境中适应1 h。测试期间,场所需进行酒精消毒。开始测试后,观察小鼠,待小鼠将头探出,平稳呼吸且无其他动作时,使用0.2 g的Von Frey细丝触碰小鼠触须垫及其周围皮肤,记录其反应。VonFrey细丝在触碰触须垫时必须完全垂直小鼠皮肤,加力直到细丝弯曲,保持弯曲状态(2-5)
16、s,在此过程中要避免与其发生刮蹭。测试在小鼠的双侧触须垫随机进行,每次触碰之间必须间隔30 s以上,每一侧触须垫重复测试至少5次。测试结束后,统计损伤侧所有分数。通过对小鼠的刺激后行为进行分类,可以得到以下刺激分数的分级(见表1):表1小鼠Von Frey机械刺激评分表分数01234机械刺激后反应无反应小鼠感受到刺激,将头转向刺激物体小鼠快速的后撤,伴或者不伴一次面部的擦拭行为(在受刺激侧)小鼠主动攻击刺激物,或有两次快速的面部擦拭行为小鼠有三次及以上的快速的面部擦拭行为资 料 来 源:Evoked and spontaneous pain assessmentduring tooth pul
17、p injury111.3.2 自发性疼痛测试在疼痛动物模型中,通过外来刺激产生的疼痛仅能评价动物的诱发性疼痛,而在实际临床中,自发性疼痛的产生是一个相对普遍的症状。在临床上,研究者可以通过问卷或描述的方式获得自发性疼痛的程度以及频率,但在动物实验中无法做到。因此,需通过观察动物行为,按照其规律制定合适的评分制度12。在本实验中,我们通过录像的方式记录小鼠在笼中的面部修饰行为,后期进行该时间段的人工计数与统计,以此来评估小鼠模型的自发痛。将小鼠放入观察场地中,使其提前适应 1 h。适应完毕后,将录像仪器安装在观察装置底部,通过录像可以较为清晰地观察小鼠的面部修饰行为。使用录像仪器记录其45 m
18、in内与自发性疼痛表现相关的面部修饰动作。之后对录像进行分析,记录小鼠使用前爪修饰面部的时间,其面部修饰的部位包括触须垫区域,面颊区域和耳朵。1.4 三叉神经节组织提取将小鼠按照对照组、手术组术后3、10、28天进行分组,每组3只,分批进行三叉神经节的提取:用10水合氯醛将小鼠深度麻醉至濒死状态,尽快打开小鼠胸腔,固定好心脏灌流装置,分三次灌入PBS溶液共30 mL,每次10 mL;灌流完毕后,剪开小鼠背颈部皮肤,使用镊子刺穿后脑,掀开小鼠颅骨,去除多余脑组织,暴露颅骨底部的两条平行颅骨的三叉神经节;取出小鼠三叉神经节,使用PBS溶液再次进行冲洗,冲洗后将组织放入冻存管中;将组织在液氮中冻存后
19、,转移至-80冰箱保存。1.5 Western Blot实验将提取完毕的组织进行蛋白提取以及WesternBlot实验。1.5.1 组织总蛋白提取组织块用预冷的PBS洗去血污,剪成小块置于匀浆管中,加入2颗4 mm的匀浆珠,加入10倍组织体积的裂解液和蛋白酶抑制剂,进行匀浆;匀浆完成后,将匀浆管放置冰上裂解液30 min,每隔5min震荡一次,确保组织完全裂解;裂解完全后,进行离心。12 000 rpm(每分钟转速),4,离心10 min,收集上清,即为总蛋白溶液。1.5.2 蛋白变性将蛋白溶液按照41的比例加入5倍还原型蛋白上样缓冲液,沸水浴变性15 min,完成变性。1.5.3 SDS-P
20、AGE电泳清洗玻璃板并晾干后,放入制胶器。固定好板子后,检查其底部是否存在漏胶;根据实验需求配制分离胶和浓缩胶,浓缩胶凝固完毕后,取下板82(Biomedical Transformation),2023年9月,第4卷,第3期子,准备电泳;将制胶器放入电泳槽,上样。浓缩胶电压用90 V,分离胶用150 V。电泳至胶板底部时停止电泳,进行转膜;准备六块海绵和一张PVDF膜,将PVDF膜用甲醇活化2 min;将转膜用夹子放入装了转膜液的盘子中,打开,黑上白下,依次放置两块海绵;剥下分离胶,将胶贴于膜上,盖上海绵,将夹子合上放入转膜仪器中。转膜条件:300 mA恒流,30 min,全程装置处于冰浴中
21、。1.5.4 抗体孵育将转完后的膜放入装有TBST的孵育槽中,涮洗一次,在室温下,用含 0.1%Tween-20的 5%脱脂奶粉在摇床上慢摇封闭膜1 h;按照抗体说明书,进行一抗稀释,配置好后,倒掉封闭液,加入配置好的一抗,4孵育摇床慢摇过夜;回收一抗,用TBST洗膜3次,然后加入TBST,放置脱色摇床上快速洗脱,每次5 min,洗3次;将二抗用TBST按比例稀释后,加入孵育槽中,放置摇床上慢摇,室温下孵育 30 min;用 TBST 洗膜 3 次,然后加入TBST,放置脱色摇床上快速洗脱,每次 5 min,洗3次。1.5.5 化学发光将 ECL A 和 B 液按照 11 比例混合,备用。将洗
22、脱完的PVDF膜取出放在吸水纸上,稍微吸干膜上的液体,加入混合好的ECL发光液,让液体完全浸没膜,待反应1 min之后,用吸水纸吸干多余液体,放入化学发光仪中,按照预设程序开始化学发光,曝光完成之后,保存原始图为TIFF格式。1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 26.0软件统计分析。数据均以平均值 标准差(x s)表示,采用单因素方差分析和 Kruskal-Wallis ANOVA检验,P 0.05表示有统计学意义。2结果2.1 机械性异常性疼痛测试在机械性异常性疼痛测试中,手术前的预实验中手术组小鼠和对照组小鼠的测试得分均在1.7左右,无明显差异。在术后第1天,手术组小鼠分数出现显著下滑
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