陕北地区苹果树根内细菌多样性分析.pdf
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1、基金项目:陕西省县域重点科技项目()陕西省科技惠民计划项目()年延安市科技局园区与县域特色经济创新链项目()延安市生物资源开发与利用科技创新团队专项基金 年陕西省农业厅农业绿色技术研发集成项目 年第八批陕西省省级农业标准化示范区项目陕西省教育厅服务地方专项计划项目()作者简介:邓振山 男教授博士 主要从事微生物资源与利用和环境微生物学研究工作:.通讯作者收稿日期:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析邓振山 郑超超 李买平 陈凯凯 柳晓东 姜影影 贺晓龙 张金龙(.延安大学 生命科学学院陕西 延安.延安市宝塔区畜牧兽医中心陕西 延安.延安市宝塔区果树中心陕西 延安)摘 要 以延安市 个不同县区苹果树
2、根为研究对象分析苹果树根内生细菌的群落组成和多样性揭示内生细菌的群落结构及多样性差异 采用高通量测序技术分析 个不同县区苹果树根内生细菌 基因 变异区序列使用生物信息学方法分析其内生细菌的群落结构及多样性 结果表明测序共获得 条有效序列在 一致性下共产生 个有效的操作分类单元()在门水平上 个样地苹果树根内生细菌群落组成中共有的优势类群分别为放线菌门()和变形菌门()其相对丰富度分别为.和.属水平上的优势菌属为假单胞菌属()、节杆菌属()、链霉菌属()、诺卡氏菌属()、叶杆菌属()、黄杆菌属()、农杆菌属()和贪噬菌属()多样性和 多样性分析表明宜川县()的 指数(.)和 指数(.)最大基于韦
3、恩图分析 个样地苹果树根内生细菌群落存在 个共有 延长县()、宝塔区()、宜川县()、洛川县()独有苹果树根内生细菌群落的 分别为、和 典范对应分析()结果表明土壤 是影响 个样地苹果树根内生细菌的群落多样性变化的主要因素 个样地苹果树根内生细菌种类丰富但群落结构组成和丰富度的差异不明显功能预测分析表明无论是 还是 均未发现显著性差异的代谢通路此结果表明苹果树根系招募了特异型有益的内生细菌菌群本研究可为苹果树根内生细菌菌种资源的开发和应用提供参考关键词 高通量测序陕北苹果树根内生细菌群落多样性中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .().(.
4、)(.).().植物内生菌()是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部以及细胞间隙不引起宿主植物发生明显病害的一类微生物 内生细菌广泛存在于多种健康植物组织的各个部位且不同部位所定殖的细菌种类、数量存在显著的差异 在植物根系中存在且寄生着数量众多、种类和功能丰富的各种微生物群落具有促进植物生长、提高植物抗逆性和降低植物病虫害发生等生理生态功能 冷雪对林地栽培人参根内生细菌的研究表明芽胞杆菌属()、寡养单胞菌属()、假单胞菌属()、节杆菌属()、肠杆菌属()、泛菌属()、微杆菌属()等为主要的根内细菌 杨光柱等基于高通量测序的苹果根际土壤细菌组成与多样性分析结果表明苹果
5、根际土壤中存在假单胞菌属、芽胞杆菌属、节杆菌属、文氏菌属()、黄杆菌属()、根瘤菌属()、沙雷氏菌属()和微杆菌属等促生微生物 内生细菌能够长期稳定地定殖于植物体内在植物体内对提高宿主抗逆和促进植物的生长发育具有明显作用 如根瘤菌属、芽胞杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属和泛菌属等植物内生细菌通过固氮、溶磷、产、分泌铁载体和产生抗菌活性物质等方式帮助宿主植物抵抗生物和非生物胁迫 因此通过对植物根内细菌多样性的研究有助于了解其核心菌群结构及功能可为土壤根内微生物与作物生产力之间的相关性研究提供理论参考对可持续农业的发展具有重要的意义 陕北地区是陕西苹果的主产区也是我国苹果的优生区之一因其独特
6、的地理位置以及环境气候等自然条件造就了陕北苹果独特的风味 近年来在苹果的生产过程中由于果农过分追求产量而施用大量化肥破坏了土壤中微生态的平衡降低了根际土壤及植物内生菌群落的多样性导致出现土壤板结、养分失调等诸多问题 鉴于此本研究以陕北 个不同地区苹果树根为研究对象利用 扩增子测序技术对苹果树根内细菌进行多样性和群落结构分析探究不同样地苹果根内细菌多样性和群落结构的差异通过免培养的高通量测序技术旨在精确评估陕北苹果树根内细菌的多样性明确其优势和特有菌群以期为苹果树根内生细菌的资源开发与利用提供一定的理论参考 材料与方法.材料.样品采集与土壤理化性质测定于 年 月从陕西延安市宝塔区、延长县、洛川县
7、和宜川县四个区县(分别编号为、和)各 期 邓振山等:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析 选三个乡镇每个乡镇选择三个以上的健康果园 年树龄砧木为昭通海棠品种为红富士 每个果园随机选取相隔一定距离且长势较好和健康的 棵苹果树植株以每棵苹果树树干为中心分别在东南西北四个方向距离树干 范围内垂直下挖 将根暴露出来釆集苹果树根样品及其周围.以内的根际土壤样品采集的样品放入无菌采集袋内低温保存带回实验室 冰箱保存备用 将 个土壤样品风干并过孔径为.筛子使用 型土壤养分测试仪器分别测定土样铵态氮()、有机质()、有效磷()和有效钾()的含量使用 酸度计分别测定各土样的 值表 各样地基本地理位置和气候信息 地理
8、位置和气候信息样品采集点宝塔区()延长县()洛川县()宜川县()经纬度海拔/年平均降水量/.年平均温度/.年平均光照/.供试培养基 培养基:酵母粉.酸性酪蛋白水解物.月示蛋白胨.葡萄糖.淀粉.丙酮酸钠.琼脂 蒸馏水 .主要试剂与仪器设备 提取试剂盒(公司)样 品 制 备 试 剂 盒 酵 母 膏、蛋白胨、蒽酮、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、乙酸、乙醚、苯胺、二苯胺、丙酮、试剂、双缩脲试剂、茚三酮、考纳斯亮蓝、碘片、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖等购自国药集团化学试剂有限公司(分析纯)土壤养分测试仪(郑州腾宇仪器仪表有限公司)酸度计(杭州联测自动化技术有限公司)紫外可见分光光度计(日本
9、岛津)高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)紫外微量分光光度计(美国)扩 增仪(美国)电泳仪(北京六一仪器厂)凝胶成像分析系统(美国)高通量测序分析委托北京诺和生物科技有限公司完成.方法.苹果树根样品中的内生细菌的分离和纯化 选择新鲜、健康、无破损的苹果树根去掉表面泥土及植物残渣等附着物先用自来水将根表面冲洗干净再用无菌水冲洗 次 在超净工台内将冲洗干净的苹果树根用无菌剪刀剪成 的小段置于无菌培养皿中酒精浸泡 后无菌水冲洗 次再用 的次氯酸钠溶液浸泡 后无菌水冲洗 次除去根表面多余的水分后置于无菌的 离心管中备用 用移液器吸取表面消毒最后一次冲洗的无菌水 涂布于 培养基上作为对照 倒
10、置恒温培养 以检验消毒效果 若对照培养基上未发现微生物生长则表明根表面消毒彻底 将上述培养基 恒温培养 根据菌落形态、颜色挑取单菌落经反复划线纯化得到纯培养物并将纯化的菌株保存()于含的甘油管中.总 的提取和 扩增结合镜检确定为单一形态的菌株并结合其菌落特征选出代表性菌株于 恒温培养 后收集菌体使用 试剂盒提取各基因组 利用 对提取的总 浓度和纯度进行检测通过 琼脂糖凝胶电泳检测总 的提 微 生 物 学 杂 志 卷取质量使用引物 和 对 进行扩增扩增程序:个循环 扩增体系为 缓冲液 ./.引物(/).聚合酶 模板 产物经回收纯化后再次电泳检测阳性样品进行文库构建.测序使用 建库试剂盒进行文库的
11、构建构建好的文库利用 公司的 平台进行测序 测序委托深圳微生态科技有限公司完成.生物信息学分析 根据测序结果将不同样品的原始序列进行拼接整理并与 数据库进行比对获得物种分类信息 运用 插件进行 和 多样性指数分析用于评估样品本身多样性和样品间微生物群落结构差异 此外应用 对不同样品微生物群体可能的功能组成进行预测 结果与分析.土壤理化性质分析 个不同样地的苹果树根土壤理化性质如表 所示、三个样地土壤样品的 值极其接近(.)均属于碱性土壤而 土壤样品的 值中性偏碱(.)、三个样地的土壤样品铵态氮的含量相近分别为.、.和./的铵态氮含量最高./总体上陕北地区苹果树根际土壤中有机质含量均较低其中、三
12、个样地的有机质含量分别为.有机质含量最高有效磷最低为./.测序数据处理通过对 个苹果树根土壤样品进行 测序共获得 条序列对所有原始序列进行质量控制、拼接去嵌合体共形成 条有效序列 稀释曲线(图)结果显示随着测序深度的增加全部样品曲线逐渐趋向平缓并达到饱和 说明随着测序的加深获得的新物种不会显著增加即测序的数据量合理 故本次测序结果可以反映各样品中微生物的真实情况可以进行下一步数据分析图 稀释曲线.图中、和 分别代表宝塔区、延长县、洛川县和宜川县 个样地 下同、.表 土壤样品的理化性质 样地编号有机质()/铵态氮()/()有效磷()/()有效钾()/()宝塔区().延长县().宜川县().洛川县
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