陕北地区苹果树根内细菌多样性分析.pdf

基金项目:陕西省县域重点科技项目()陕西省科技惠民计划项目()年延安市科技局园区与县域特色经济创新链项目()延安市生物资源开发与利用科技创新团队专项基金 年陕西省农业厅农业绿色技术研发集成项目 年第八批陕西省省级农业标准化示范区项目陕西省教育厅服务地方专项计划项目()作者简介:邓振山 男教授博士 主要从事微生物资源与利用和环境微生物学研究工作:.通讯作者收稿日期:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析邓振山 郑超超 李买平 陈凯凯 柳晓东 姜影影 贺晓龙 张金龙(.延安大学 生命科学学院陕西 延安.延安市宝塔区畜牧兽医中心陕西 延安.延安市宝塔区果树中心陕西 延安)摘 要 以延安市 个不同县区苹果树根为研究对象分析苹果树根内生细菌的群落组成和多样性揭示内生细菌的群落结构及多样性差异 采用高通量测序技术分析 个不同县区苹果树根内生细菌 基因 变异区序列使用生物信息学方法分析其内生细菌的群落结构及多样性 结果表明测序共获得 条有效序列在 一致性下共产生 个有效的操作分类单元()在门水平上 个样地苹果树根内生细菌群落组成中共有的优势类群分别为放线菌门()和变形菌门()其相对丰富度分别为.和.属水平上的优势菌属为假单胞菌属()、节杆菌属()、链霉菌属()、诺卡氏菌属()、叶杆菌属()、黄杆菌属()、农杆菌属()和贪噬菌属()多样性和 多样性分析表明宜川县()的 指数(.)和 指数(.)最大基于韦恩图分析 个样地苹果树根内生细菌群落存在 个共有 延长县()、宝塔区()、宜川县()、洛川县()独有苹果树根内生细菌群落的 分别为、和 典范对应分析()结果表明土壤 是影响 个样地苹果树根内生细菌的群落多样性变化的主要因素 个样地苹果树根内生细菌种类丰富但群落结构组成和丰富度的差异不明显功能预测分析表明无论是 还是 均未发现显著性差异的代谢通路此结果表明苹果树根系招募了特异型有益的内生细菌菌群本研究可为苹果树根内生细菌菌种资源的开发和应用提供参考关键词 高通量测序陕北苹果树根内生细菌群落多样性中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .().(.)(.).().植物内生菌()是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部以及细胞间隙不引起宿主植物发生明显病害的一类微生物 内生细菌广泛存在于多种健康植物组织的各个部位且不同部位所定殖的细菌种类、数量存在显著的差异 在植物根系中存在且寄生着数量众多、种类和功能丰富的各种微生物群落具有促进植物生长、提高植物抗逆性和降低植物病虫害发生等生理生态功能 冷雪对林地栽培人参根内生细菌的研究表明芽胞杆菌属()、寡养单胞菌属()、假单胞菌属()、节杆菌属()、肠杆菌属()、泛菌属()、微杆菌属()等为主要的根内细菌 杨光柱等基于高通量测序的苹果根际土壤细菌组成与多样性分析结果表明苹果根际土壤中存在假单胞菌属、芽胞杆菌属、节杆菌属、文氏菌属()、黄杆菌属()、根瘤菌属()、沙雷氏菌属()和微杆菌属等促生微生物 内生细菌能够长期稳定地定殖于植物体内在植物体内对提高宿主抗逆和促进植物的生长发育具有明显作用 如根瘤菌属、芽胞杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属和泛菌属等植物内生细菌通过固氮、溶磷、产、分泌铁载体和产生抗菌活性物质等方式帮助宿主植物抵抗生物和非生物胁迫 因此通过对植物根内细菌多样性的研究有助于了解其核心菌群结构及功能可为土壤根内微生物与作物生产力之间的相关性研究提供理论参考对可持续农业的发展具有重要的意义 陕北地区是陕西苹果的主产区也是我国苹果的优生区之一因其独特的地理位置以及环境气候等自然条件造就了陕北苹果独特的风味 近年来在苹果的生产过程中由于果农过分追求产量而施用大量化肥破坏了土壤中微生态的平衡降低了根际土壤及植物内生菌群落的多样性导致出现土壤板结、养分失调等诸多问题 鉴于此本研究以陕北 个不同地区苹果树根为研究对象利用 扩增子测序技术对苹果树根内细菌进行多样性和群落结构分析探究不同样地苹果根内细菌多样性和群落结构的差异通过免培养的高通量测序技术旨在精确评估陕北苹果树根内细菌的多样性明确其优势和特有菌群以期为苹果树根内生细菌的资源开发与利用提供一定的理论参考 材料与方法.材料.样品采集与土壤理化性质测定于 年 月从陕西延安市宝塔区、延长县、洛川县和宜川县四个区县(分别编号为、和)各 期 邓振山等:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析 选三个乡镇每个乡镇选择三个以上的健康果园 年树龄砧木为昭通海棠品种为红富士 每个果园随机选取相隔一定距离且长势较好和健康的 棵苹果树植株以每棵苹果树树干为中心分别在东南西北四个方向距离树干 范围内垂直下挖 将根暴露出来釆集苹果树根样品及其周围.以内的根际土壤样品采集的样品放入无菌采集袋内低温保存带回实验室 冰箱保存备用 将 个土壤样品风干并过孔径为.筛子使用 型土壤养分测试仪器分别测定土样铵态氮()、有机质()、有效磷()和有效钾()的含量使用 酸度计分别测定各土样的 值表 各样地基本地理位置和气候信息 地理位置和气候信息样品采集点宝塔区()延长县()洛川县()宜川县()经纬度海拔/年平均降水量/.年平均温度/.年平均光照/.供试培养基 培养基:酵母粉.酸性酪蛋白水解物.月示蛋白胨.葡萄糖.淀粉.丙酮酸钠.琼脂 蒸馏水 .主要试剂与仪器设备 提取试剂盒(公司)样 品 制 备 试 剂 盒 酵 母 膏、蛋白胨、蒽酮、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、乙酸、乙醚、苯胺、二苯胺、丙酮、试剂、双缩脲试剂、茚三酮、考纳斯亮蓝、碘片、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖等购自国药集团化学试剂有限公司(分析纯)土壤养分测试仪(郑州腾宇仪器仪表有限公司)酸度计(杭州联测自动化技术有限公司)紫外可见分光光度计(日本岛津)高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)紫外微量分光光度计(美国)扩 增仪(美国)电泳仪(北京六一仪器厂)凝胶成像分析系统(美国)高通量测序分析委托北京诺和生物科技有限公司完成.方法.苹果树根样品中的内生细菌的分离和纯化 选择新鲜、健康、无破损的苹果树根去掉表面泥土及植物残渣等附着物先用自来水将根表面冲洗干净再用无菌水冲洗 次 在超净工台内将冲洗干净的苹果树根用无菌剪刀剪成 的小段置于无菌培养皿中酒精浸泡 后无菌水冲洗 次再用 的次氯酸钠溶液浸泡 后无菌水冲洗 次除去根表面多余的水分后置于无菌的 离心管中备用 用移液器吸取表面消毒最后一次冲洗的无菌水 涂布于 培养基上作为对照 倒置恒温培养 以检验消毒效果 若对照培养基上未发现微生物生长则表明根表面消毒彻底 将上述培养基 恒温培养 根据菌落形态、颜色挑取单菌落经反复划线纯化得到纯培养物并将纯化的菌株保存()于含的甘油管中.总 的提取和 扩增结合镜检确定为单一形态的菌株并结合其菌落特征选出代表性菌株于 恒温培养 后收集菌体使用 试剂盒提取各基因组 利用 对提取的总 浓度和纯度进行检测通过 琼脂糖凝胶电泳检测总 的提 微 生 物 学 杂 志 卷取质量使用引物 和 对 进行扩增扩增程序:个循环 扩增体系为 缓冲液 ./.引物(/).聚合酶 模板 产物经回收纯化后再次电泳检测阳性样品进行文库构建.测序使用 建库试剂盒进行文库的构建构建好的文库利用 公司的 平台进行测序 测序委托深圳微生态科技有限公司完成.生物信息学分析 根据测序结果将不同样品的原始序列进行拼接整理并与 数据库进行比对获得物种分类信息 运用 插件进行 和 多样性指数分析用于评估样品本身多样性和样品间微生物群落结构差异 此外应用 对不同样品微生物群体可能的功能组成进行预测 结果与分析.土壤理化性质分析 个不同样地的苹果树根土壤理化性质如表 所示、三个样地土壤样品的 值极其接近(.)均属于碱性土壤而 土壤样品的 值中性偏碱(.)、三个样地的土壤样品铵态氮的含量相近分别为.、.和./的铵态氮含量最高./总体上陕北地区苹果树根际土壤中有机质含量均较低其中、三个样地的有机质含量分别为.有机质含量最高有效磷最低为./.测序数据处理通过对 个苹果树根土壤样品进行 测序共获得 条序列对所有原始序列进行质量控制、拼接去嵌合体共形成 条有效序列 稀释曲线(图)结果显示随着测序深度的增加全部样品曲线逐渐趋向平缓并达到饱和 说明随着测序的加深获得的新物种不会显著增加即测序的数据量合理 故本次测序结果可以反映各样品中微生物的真实情况可以进行下一步数据分析图 稀释曲线.图中、和 分别代表宝塔区、延长县、洛川县和宜川县 个样地 下同、.表 土壤样品的理化性质 样地编号有机质()/铵态氮()/()有效磷()/()有效钾()/()宝塔区().延长县().宜川县().洛川县().注:表中数据为均数 标准偏差不同小写字母表示处理间不同的显著性差异(.).多样性分析.多样性指数统计分析由表 中的结果可以看出 个样地中各样品根内生细菌菌群种类的、指数以及 和 指数存在一定的差异性说明 个样地中各样品根际细菌群落组成的 期 邓振山等:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析 多样性存在显著性差异(且样地内样品根内生细菌群落的 指数和 指数也 结果表明 组中各样品根内生细菌群落的多样性和丰富度最高 分组中各样品根内生细菌群落的多样性和丰富度最低 因此各样地间根内细菌群落多样性表现为 表 苹果树根内生细菌的 多样性 样品编号 指数 指数有效 指数 指数.注:表中数据为均数 表示标准方差同列数据后不同字母表示显著性差异(其中 和 中共有的 个 和 共有的 个 和 共有的 个 和 共有的 个 和 共有的 个 和 共有的 个 由此可知 与 共有的 数量最多因此这两个样地间的多样性差异相较于其他样地间最小 与 共有的 最少 个样地苹果树根内生细菌中丰富度最高的前 个属共归类为拟杆菌门()、放线菌门()、厚壁菌门()和变形菌门()个门其中变形菌门的菌属最多占比 其次是放线菌门 拟杆菌门(.)和厚壁菌门(.)占比最低 其中样地 中假单胞菌属()的丰富度最高其次是微小杆菌属()和贪噬菌属()样地 中丰富度较高的是根瘤菌属()和 样地 中丰富度最高的为芽胞杆菌属()和农杆菌属()样地 中各样品间的丰富度较低且差异较小 因此这两个样地间的多样性差异相较于其他样地间最大 该结果表明不同地域间各样地苹果树根内细菌群落均含有各自特有的组成同时也存在一定数量的共有菌群图 不同采样点苹果树根内生细菌群落 分布的 图.不同样地间的微生物群落的组成及结构分析 基于相似度为 有效序列进行操作分类单元聚类()对各样地的苹果树根内生细菌在不同分类水平上进行群落组成及结构分析 在门分类水平上 个样地苹果根内生细菌群落组成存在一定的差异各样地的内生细菌群落组成中共有且丰富度较高的均为放线菌门和变形菌门其相对丰富度分别为.和.样地 中丰富度较高的种类还包括拟杆菌门为.而在其他 个样地内的相对丰富度为.在样地 和 中放线菌门的相对丰富度较 和 高在样地 和 中变形菌门的相对丰富度较 和 高且样地 中变形菌门的相对丰富度最高 由此可知 个样地苹果树根内生优势菌 微 生 物 学 杂 志 卷门组成及丰富度存在差异(图)不同样地苹果树根内细菌群落组成及构成在属水平上存在较大的差异(图)样地 的优势菌属为假单胞菌属(.)、节杆菌属(.)、链霉菌属()(.)、农杆菌属(.)和贪噬菌属(.)样地 的优势菌属为节杆菌属(.)、假单胞菌属(.)、诺卡氏菌科()中的未定属(.)、链霉菌属(.)样地 的优势菌属与样地 各样品的优势菌属种类相同其相对丰富度分别为.、.、.、.和.样地 的优势菌属为假单胞菌属(.)、节杆菌属(.)、黄杆菌属()(.)、链霉菌属(.)、叶杆菌属()(.)、农 杆 菌 属(.)和 贪 噬 菌 属(.)此外 个样地中均存在大量的相对丰富度较低的未分类菌属 其相对丰富度为.说明在 个样地中各样品根内生细菌群落中有大量未分离和未分类菌属(图)图 不同样地内生菌群落在门水平上的物种组成.图 不同样地内生菌群落在属水平上的物种组成.多样性分析.多样性指数统计分析基于 距离进行 ()分析选取贡献率最大的主坐标 期 邓振山等:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析 组合作图 处理间距离越接近表示苹果树根内生细菌群落组成结构越相似因此群落结构相似度高的处理聚集在一起群落差异很大的样地则被分开 图 为基于 距离的苹果树根内生细菌群落主坐标分析()两轴形成的第一个平面共解释了 水平苹果树根内生细菌群落结构变化的.结果显示虽然样地 与其他 个样地各点距离较远但是没有明显被分开 同时 相似性分析结果也显示样地 与其他样地间菌群组成相似其中 的 .的 .的 .且、样地内的各样品之间表现出明显的组内聚集均没有区分开 由此可知总体上这 个样地中各样品具有极相似的苹果树根内生细菌群落结构图 基于 的不同样地的苹果树根中内生菌群落组成 分析.环境因子关联性分析为了研究影响不同样地苹果树根内细菌群落分布的主要环境条件进一步明确各样地内生细菌群落组成与土壤理化因子的关系采用冗余分析通过 对土壤理化性质和各样地内生细菌群落组成之间的关系进行研究(图)在属水平上的结果表明第一排序轴 和第二排序轴 分别解释了苹果树根内细菌群落变化的.和.两者共解释了.(.)结果表明土壤理化性质和各样地内生细菌群落组成存在不同程度的影响其中影响最大的是土壤 (.)其他分别为有机质()(.)、硝态氮()(.)、有效钾()(.)、有效磷()(.)、铵态氮()(.)图 属水平各样地细菌与土壤性质的冗余分析.功能预测分析本研究通过 方法分析各样地样品在代谢过程中的潜在功能分析细菌 同源序列()下的第一层级()和第二层级()基于 下的 、水平均未发现具有显著性差异的代谢通路(.且 结果表明样地 中各样品内生细菌群落的多样性和丰富度最高样地 中各样品内生细菌群落的多样性和丰富度最低细菌群落变异性受地点、植物部位和植物基因型的影响 等对不同基因型的柳枝稷和哈氏黍的微生物群落进行了比较根际和根内样本的细菌群落分析结果表明根际样本按位点明显分离而根内群落没有按位点明显分离即位点影响根际微生物群落但不影响根内微生物群落根际和根内中最丰富的细菌分类群包括放线杆菌、和 变形菌种植地点显著影响黍类牧草对根际微生物的招募而根内生微生物群落受不同位点的影响不大植物可以作为微生物群落的“过滤器”成功招募特定的内生菌 宋庭宁等发现相同植物不同地点的内生细菌群落种类无明显差异但存在菌落数量上的差异与本研究结果一致本研究结果表明 个不同样地属水平上的优势菌属均为假单胞菌属、节杆菌属、链霉菌属()、诺 卡 氏 菌 属()、叶杆菌属()、黄杆菌属()、农杆菌属()和贪噬菌属()苹果树根内的细菌群落及其核心菌群均未受到采样位点的显著影响 多样性和系统进化分析进一步表明 个样地中各样品内生细菌的群落组成结构相似度较高表明研究的苹果树根内的细菌群落组成严格受到其宿主植物的选择尤其是当植物体受到环境胁迫的情况下会招募特定种类的微生物帮助其渡过不良环境条件因而导致其微生物群落结构具有较强的保守性 但这些相似性是否与相关功能基因一致相匹配从而使得苹果树适应陕北地区当地条件下的土壤化学和物理特征还有待于进一步研究本研究 分析表明 是影响不同样地苹果树根内生细菌群落分布的主要环境变量 等研究结果表明 为内生细菌分布差异的主要因素 何冬华等的研究结果表明土壤 对内生固氮菌菌群的结构也产生显著影响蔡树美等研究结果表明土壤有机质、氨态氮、速效磷与根内生固氮菌菌群结构有关 本研究与前人的研究结果一致 结果表明不同样地苹果树根内生细菌群落结构受多个环境因子变量的影响和控制本研究土壤速效磷与根内细菌群落的相关性较小这与 等发现速效磷对根内生细菌分布也会产生显著影响的结果不一致这可能是由于根内分布的与磷吸收和利用有关的菌群丰富度较低导致的通过对 个样地苹果树根内生细菌群落的功能预测发现 个样地各苹果树根内生细菌的功能组成差异较小此结果与、多样性分析一致表明陕北苹果树招募具有相同功能的特定根内细菌群落 有研究表明节杆菌属()细菌具有很强的环境适应性和抗逆性假单胞菌属()是常见的具有防治植物病害和促进植物生长的生防菌 在多个苹果树根内生菌中检测到的优势种属还包括尤泽比氏菌属()、鞘脂单胞菌属()、盐单胞菌属()、红色杆菌属()、芽胞杆菌属()等具有一定促生抗逆相关的有益功能性状的微生物类群 本研究所涉及的相关功能基因类型还较少很多生理功能仍不清楚还有待于深入研究参考文献:.():.王志伟 纪燕玲 陈水敢.植物内生菌研究及其科学意义.微生物学通报 ():.冷雪.人参内生与根际细菌多样性分析及促生细菌的分离鉴定.延吉:延边大学.杨光柱黄文静郑丽萍 等.基于高通量测序的苹果根腐病病株和健株根际土壤细菌组成与多样性分析.西南农业学报():.微 生 物 学 杂 志 卷 黄敬瑜 张楚军 姚瑜龙 等.植物内生菌生物抗菌活性物质研究进展.生物工程学报 ():.():.():.王斌 张凯 李龙 等.浅析苹果园土壤改良存在的问题及对策.陕西农业科学 ():.张喜龙 赵政阳.浅议山地苹果对柳林镇经济与社会发展的作用.陕西林业科技():.陈泽斌 夏振远 雷丽萍 等.非培养方法解析烟草根部内生细菌的群落结构.华北农学报 ():.():.():.():.刘佩杭.不同树龄苹果根际土壤线虫与微生物多样性研究.石家庄:河北农业大学.:.宋庭宁 洪宗国 曹夕 等.种药用植物的 个组织的内生细菌多样性初步分析.绿色科技():.():.何冬华 沈秋兰 徐秋芳 等.不同年限毛竹林土壤固氮菌群落结构和丰度的演变.土壤学报 ():.蔡树美 徐四新 张翰林 等.滩涂土壤固氮菌群落与环境因子的典范对应分析.土壤 ():.():.():.():.():.期 邓振山等:陕北地区苹果树根内细菌多样性分析