拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定.pdf
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1、引文格式:吴钒漳,孙旭东,徐慧妮.拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定J.云南农业大学学报(自然科学),2023,38(4):558565.DOI:10.12101/j.issn.1004-390X(n).202202008拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定*吴钒漳1,孙旭东2,徐慧妮1*(1.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明650500;2.中国科学院昆明植物研究所,云南昆明650201)摘要:【目的】筛选拟南芥中 NBS1 的互作蛋白,探究 NBS1 蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥 cDNA 文库,对得到的序列进行 BLAST 比对、亚
2、细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有 221 个阳性克隆,测序后通过 BLAST 比对得到 97 个与 NBS1 互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于 4 个分子功能、5 个细胞组分和 13 个生物过程。【结论】拟南芥中与 NBS1 互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明 NBS1 是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。关键词:拟南芥;NBS1;蛋白互作;酵母双杂交;基因本体注释中图分类号:Q949.748.306文献标志码:A文章编号:1004390X(2023)04055808Scr
3、eening and Identifying Interaction Proteins ofNBS1 in Arabidopsis thalianaWUFanzhang1,SUNXudong2,XUHuini1(1.FacultyofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China;2.KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Kunming650201,China)Abstract:PurposeToscreenth
4、einteractionproteinandexplorethenewfunctionofNBS1pro-teininArabidopsis thaliana,layingthefoundationforfurtherresearch.MethodsTheyeasttwo-hybridtechnologywasusedtoscreentheinteractionproteinsofNBS1fromA.thalianacDNAlib-rary.BLASTalignment,subcellularlocalizationanalysisandgeneontologyannotationswerep
5、er-formedontheobtainedsequences.ResultsTherewere97proteinsinteractedwithNBS1in221positiveclonesbyBLASTaftersequencing,includingmembraneproteins,transportersandfoldingproteins.Theseproteinsweremainlylocalizedincytoplasm,nucleusandchloroplast,whichweremainlyenrichedinfourmolecularfunctions,fivecellula
6、rcomponentsand13biologicalprocesses.ConclusionTheproteinsinteractingwithNBS1playanimportantroleinstimulusresponse,sig-naltransductionandcellmetabolism.ItisalsoconfirmedthatNBS1isamultifunctionalprotein,butitsfunctionandmolecularmechanismneedfurtherstudies.Keywords:Arabidopsis thaliana;NBS1;proteinin
7、teraction;yeasttwo-hybrid;geneontology云南农业大学学报(自然科学),2023,38(4):558565http:/JournalofYunnanAgriculturalUniversity(NaturalScience)E-mail:收稿日期:2022-02-16修回日期:2022-03-02网络首发日期:2023-09-06*基金项目:国家自然科学基金项目(31760582)。作者简介:吴钒漳(1995),男,陕西府谷人,在读硕士研究生,主要从事分子生物学研究。E-mail:*通信作者 Correspondingauthor:徐慧妮(1980),女,山东
8、莱阳人,博士,教授,主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。E-mail:网络首发地址:https:/ 损伤,其中 DNA 双链断裂(double-strandbreakage,DSBs)是一种非常严重的损伤,若不及时修复会影响基因组的稳定,甚至导致细胞死亡1。同源重组(homologousrecombination,HR)和非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)是植物 DSBs 修复的 2 种途径2,使基因组受到损伤后仍然能够被精确地修复。HR 主要发生在细胞周期的 S 期,以姐妹染色单体或同源染色体为模板进行修复,准确率极高;而 NHEJ发生在整个细胞周
9、期,通过连接 DNA 末端来修复 DSBs,这种方法虽然明显快于 HR 修复,但准确率低于 HR 途径,而且会导致遗传信息丢失3。MRN 复合物是由 3 种蛋白质(MRE11、RAD50 和NBS1)组成的基因修复复合体,在 DSBs 修复的2 种途径中发挥着重要作用,参与起始修复、引发信号转导和协助修复等各个环节4-5。NBS1 是 MRN 复合物的重要组分,是细胞应答 DNA 损伤的关键蛋白,在 DNA 复制、DSBs识别、细胞周期调控和维持基因组稳定等方面具有重要作用6。NBS1 蛋白主要分为 3 个结构域:N 端、中心区和 C 端。其中,N 端包含 FHA 结构域和 BRCT 结构域,
10、这 2 种结构域与 DNA 损伤修复和细胞周期调控相关7-9。FHA/BRCT 结构域能够直接结合磷酸化后的组蛋白 H2AX,招募MRN 复合物到 DNA 双链断裂的位点附近10-11。研究发现:BCAS2 可以与 NBS1 的 N 端互作,增强 DNA 双链断裂的修复能力12。中心区含有若干个丝氨酸残基,当 DNA 双链发生断裂时,这些丝氨酸残基会被 ATM 磷酸化,与 NBS1 一起参与细胞周期 S 期的调控13-14。NBS1 蛋白的C 端含有 MRE11 的结合位点,NBS1 通过该位点与 MRE11 结合并与 RAD50 共同组成 MRN 复合体,同时参与 MRN 复合物的核转位15
11、。本研究通过拟南芥酵母文库筛选得到 97 个与 NBS1 互作的蛋白,为后续研究拟南芥 NBS1 蛋白的功能及其分子机制奠定基础。1 材料与方法1.1试验材料试验所用拟南芥品种为哥伦比亚(ColumbiaCol-0),酵母培养基购自北京酷莱博科技有限公司,拟南芥的 cDNA 文库、酵母菌株 Y2HGold、Y187、大肠杆菌 DH5、酵母双杂交载体 pGADT7(AD)和 pGBKT7(BD)均为中国科学院昆明植物研究所实验室保存。1.2重组载体的构建利用 EastepSuper 总 RNA 提取试剂盒提取拟南芥总 RNA,再用 5All-In-OneRTMasterMix试剂盒合成 cDNA
12、。以 cDNA 为模板,用 NBS1 基因特异性引物 NBS1-F:GAGGACCTGCATATG-ATGGTTTGGGGTCTCTTTCCC 和NBS1-R:CA-GGTCGACGGATCCTCAACTTCCAGAGAGAAA-CCC 扩增得到 NBS1 的基因序列。胶回收后用同源重组法将 NBS1 基因重组到 BD 载体上,再转化到大肠杆菌 DH5 中,37 过夜培养。挑取单菌落进行 PCR 扩增,将阳性克隆送至擎科生物有限公司测序。1.3重组载体的自激活检测将测序正确的 BD-NBS1 重组载体转化到酵母菌株 Y2HGold 中,用 SD/-Trp 平板筛选,同时转化 AD 和 BD 空
13、载体作为阴性对照。将转 AD空载体的 Y187 菌株分别与转 BD 空载体和 BD-NBS1 重组载体的 Y2HGold 菌株共同培养 12h,培养液稀释后涂布于 SD/-Trp/-Leu 和 SD/-Trp/-Leu/-Ade 平板上,28 培养 23d,检测其自激活活性。1.4酵母 cDNA 文库筛选互作蛋白将转 BD-NBS1 重组载体的酵母 Y2HGold 菌株培养到 OD2600.8,再与含 cDNA 文库的 Y187菌株混合培养 24h,离心集菌后用 0.5YPDA 液体培养基 10mL 悬浮菌体,涂到 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His 平板上,28 培养 34d。挑取
14、单菌落,吸取菌液 1L 进行 PCR 检测,将阳性克隆送至擎科生物科技有限公司测序,分析测序结果。为了验证筛选结果的可靠性,随机挑选 4 个候选蛋白,利用同源重组法将基因重组到 AD 载体上,与 BD-NBS1 质粒共同转化酵母菌株 Y2HGold,涂 SD/-Trp/-Leu 平板,28 培养 23d。挑取单菌落,然后稀释培养液,吸取菌液 1L 点至 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His 平板上,28 培养 34d。2 结果与分析2.1重组载体 BD-NBS1以拟南芥 cDNA 为模板克隆 NBS1 基因,大小为 1629bp(图 1a);单菌落 PCR 进行扩增(图 1b)第4期吴
15、钒漳,等:拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定559后成功获得 BD-NBS1 的重组载体。2.2重组载体 BD-NBS1 的自激活活性由图 2 可知:重组载体 BD-NBS1 经转化、培养后,SD/-Trp/-Leu/-Ade 平板上无菌落生长,说明 BD-NBS1 重组载体在酵母菌株 Y2HGold 中无自激活现象,可用于后续酵母文库的筛选。2.3互作蛋白的筛选结果研究共获得221 个阳性克隆,测序后通过TAIRBLAST 进行比对分析,得到 97 个与 NBS1 互作的蛋白,其亚细胞定位结果见表 1。2 000 bpa)b)Maker121 000 bp750 bp500 bp250
16、bp100 bp2 000 bpMaker121 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp注:a)RT-PCR 扩增 NBS1,1 和 2 为 RT-PCR 产物;b)BD-NBS1 菌落 PCR 扩增,1 和 2 为 BD-NBS1 重组菌落 PCR 扩增产物。Note:a)RT-PCRamplificationofNBS1,1and2areRT-PCRproducts;b)colonyPCRamplificationofBD-NBS1,1and2areBD-NBS1recombinantcolonyPCRamplificationproducts.图 1 BD-NBS1
17、 重组载体的构建Fig.1ConstructionofrecombinantvectorBD-NBS1AD+BDAD+BD-NBS1-Leu,-Trp-Leu,-Trp,-AdeAD+BDAD+BD-NBS1图 2 BD-NBS1 自激活检测Fig.2IdentificationofBD-NBS1forauto-activation表 1 NBS1 结合蛋白及其功能分析Tab.1FunctionalanalysisofNBS1bindingproteins编号number基因座位genelocus亚细胞定位subcellularlocalization蛋白描述proteindescriptio
18、n功能预测functionalprediction1AT2G17720线粒体mitochondrion2-酮戊二酸和铁依赖性加氧酶蛋白2-oxoglutarateandFe(II)-dependentoxygenaseprotein铁离子结合ironionsbinding2AT1G35190细胞质cytoplasm2-酮戊二酸和铁依赖性加氧酶蛋白2-oxoglutarateandFe(II)-dependentoxygenaseprotein铁离子结合ironionsbinding3AT1G12440细胞核nucleus锌指家族蛋白zincfingerfamilyproteinDNA结合DNA
19、binding4AT4G37000叶绿体chloroplast红叶绿素分解代谢还原酶redchlorophyllcatabolitereductase蛋白质结合proteinbinding5AT2G21620细胞质cytoplasm腺嘌呤核苷酸水解酶adeninenucleotidealphahydrolases水解酶活性hydrolaseactivity6AT5G67560液泡vacuoleADP-糖基化因子ADP-ribosylationfactorGTP结合GTPbinding7AT3G48690细胞核nucleus/-水解酶超家族蛋白alpha/beta-hydrolasessuper
20、familyprotein水解酶活性hydrolaseactivity8AT3G11680叶绿体chloroplast苹果酸转运蛋白malatetransporter转运蛋白活性transporteractivity9AT2G38710叶绿体chloroplastAMMECR1家族蛋白AMMECR1familyprotein催化活性catalyticactivity10AT5G40160叶绿体chloroplast锚蛋白重复家族蛋白ankyrinrepeatfamilyprotein蛋白质结合proteinbinding11AT3G22110线粒体mitochondria20S蛋白酶体亚基20
21、Sproteasomealphasubunit水解酶活性hydrolaseactivity560云南农业大学学报第38卷表1(续)编号number基因座位genelocus亚细胞定位subcellularlocalization蛋白描述proteindescription功能预测functionalprediction12AT4G14440细胞核nucleus3-羟乙基辅酶A脱水酶13-hydroxyacyl-CoAdehydratase1水合酶活性hydrataseactivity13AT2G19590细胞质cytoplasmACC氧化酶ACCoxidase氧化酶活性oxidaseactiv
22、ity14AT1G59910细胞核nucleus肌动蛋白结合FH2家族蛋白actin-bindingFH2familyprotein肌动蛋白结合actinbinding15AT3G05420细胞质cytoplasm酰基辅酶A结合蛋白acyl-CoAbindingprotein酰基辅酶A结合acyl-CoAbinding16AT2G41445线粒体mitochondriaMADS-box蛋白MADS-boxprotein蛋白质结合proteinbinding17AT3G28940细胞核nucleusAIG2家族蛋白AIG2familyprotein催化活性catalyticactivity18A
23、T4G36250细胞质cytoplasm醛脱氢酶aldehydedehydrogenase醛脱氢酶活性aldehydedehydrogenaseactivity19AT5G13420叶绿体chloroplastTIM家族蛋白TIMfamilyprotein转醛酶活性transaldolaseactivity20AT3G42790细胞核nucleusALFIN家族蛋白ALFINfamilyprotein甲基化组蛋白结合methylatedhistonebinding21AT4G22260线粒体mitochondria氧化酶家族蛋白oxidasefamilyprotein氧化酶活性oxidasea
24、ctivity22AT1G19130细胞核nucleusRMLC折叠蛋白RMLCfoldprotein催化活性catalyticactivity23AT4G33780叶绿体chloroplastATP磷酸核糖转移酶ATPphosphoribosyltransferase蛋白质结合proteinbinding24AT4G32530液泡vacuoleV-ATP酶家族蛋白V-ATPasefamilyproteinATP水解活性ATPhydrolysisactivity25AT1G31770质膜plasmamembraneATP结合盒式转运蛋白ATP-bindingcassettetransporte
25、r转运蛋白活性transporteractivity26AT1G67730线粒体mitochondria-酮酰基还原酶beta-ketoacylreductase氧化还原酶活性oxidoreductaseactivity27AT5G20230质膜plasmamembrane蓝铜结合蛋白blue-copper-bindingprotein电子转移活性electrontransferactivity28AT4G33430质膜plasmamembraneBRI1相关受体激酶BRI1-associatedreceptorkinase信号受体结合signalingreceptorbinding29AT2
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