麻痹性贝类毒素研究进展.pdf
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1、刑事技术综 述2023 年 第 48 卷 第 4 期 基金项目:国家重点研发计划(2018YFC1602705);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2020JB007)第一作者简介:张曌,女,山西吕梁人,硕士研究生,研究方向为毒物检验。E-mail:*通信作者简介:王芳琳,女,北京人,学士,研究员,研究方向为食品安全检验、毒物检验。E-mail: 栾玉静,女,山东龙口人,博士,研究员,研究方向为食品安全检验。E-mail: 网络首发时间:2022-09-20;网络首发地址:https:/doi.org/10.16467/j.1008-3650.2022.0058DOI:10.16
2、467/j.1008-3650.2022.0058麻痹性贝类毒素研究进展 张 曌1,栾玉静2,*,韩昱哲1,王芳琳2,*(1.山西医科大学法医学院,山西 晋中 030600;2.公安部鉴定中心,北京 100038)摘 要:麻痹性贝类中毒在全球贝类中毒中最常见,分布最广、危害最大、死亡率最高,对人民生命健康造成极大威胁。麻痹性贝类毒素毒性很大,人口服不到 1 mg 便可致死,对神经和肌肉具有麻痹作用,影响生物神经系统和心血管系统。麻痹性贝类毒素衍生物众多且结构相似,可以相互转化,检测难度大。本文综述了麻痹性贝类毒素的性质、作用机制、中毒症状和代谢途径,并对固相萃取法、分散固相萃取法、免疫亲和层析
3、法等前处理方法以及小鼠生物法、免疫分析法、液相色谱 荧光检测法、液相色谱 质谱联用法等相关检测方法进行了总结,以期为麻痹性贝类毒素的研究,有关检测方法的开发与完善,法庭科学毒物检验以及相关标准的制定提供参考。关键词:法医毒物分析;麻痹性贝类毒素;前处理;检测技术中图分类号:DF795.1 文献标识码:A 文章编号:1008-3650(2023)04-0418-08 Evolutional Researches about Detection of Paralytic Shellfi sh ToxinsZHANG Zhao 1,LUAN Yujin g 2,*,HAN Yuzhe 1,WANG
4、Fanglin 2,*(1.School of Forensic Medicine,Shanxi Medical University,Jinzhong 030600,Shanxi,China;2.Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,Beijing 100038,China)ABSTRACT:Paralytic shellfish poisoning is globally among the most commonly-seen poisoning incidents resulted from shellfi
5、sh,posing huge threat to peoples life and health with its widest distribution,greatest harm and highest mortality(its oral-lethal dose less than 1mg for human).Paralytic shellfish poisoning is caused from the highly-toxic paralytic toxins of shellfish.The paralytic shellfish toxins(PSTs)are able to
6、paralyze nerves and muscles and affect both the nerval and cardiovascular systems.PSTs have many kinds and structure-similar derivatives that can transform into one another,hence conducing diffi culties to detect them.A review was here carried out into the PSTs about their properties,mechanism of ac
7、tion,toxic symptoms and metabolic pathways,having summarized the relating pretreatment methods of solid-phase extraction,dispersive solid-phase extraction and immunoaffi nity chromatography,and successively discussed the applicable detection choices including the biologically-infected mouse approach
8、,immunoassay,liquid-chromatography fl uorescent detection and liquid chromatography-mass spectrometry.Therefore,valuable references should be capable of providing with this review for the concerned people to research PSTs,develop and improve relevant detection performance,examine correlative forensi
9、c-signifi cant toxins and stipulate involving norms and standards.KEY WORDS:forensic toxicology analysis;paralytic shellfi sh toxins;pretreatment;detection technology贝类中毒多伴随群体性中毒事件,具有家族性、突发性、地域性,会导致众多人员中毒和死亡,造成的社会危害极大,日益引起社会重视。贝类以摄食有毒藻类来积累毒素,经由食物链传导引起人中4192023 年 第 48 卷 第 4 期张,等:麻痹性贝类毒素研究进展 毒,毒素在贝体内为
10、结合态,进入人体后迅速解离产生毒性。其中麻痹性贝类毒素(paralytic shellfi sh toxins,PSTs)毒性最强,危害最重,沿海地区多高发。因毒素存在季节性变化特征,贝类中毒常发生在秋冬季节。据统计全球每年因误食被 PSTs 污染的贝类而中毒的有 2 000 多人,死亡率达 15%。历史上最早报道的是 1793 年南美洲的哥伦比亚发生的贝类中毒致死案件1,此后各国陆续报道了许多贝类中毒案例,1987 年发生在危地马拉的麻痹性贝类毒素中毒事件,造成 187 人中毒2。我国中毒案件主要集中在福建等地,1988 年报道了第一例发生在福建的因赤潮引起麻痹性贝类毒素中毒的案例,有 13
11、6 人中毒,59 人重患,1 人死亡3。此后中毒案件频发,2017 年福建漳州发生的一起麻痹性贝类毒素中毒事件造成了 164 人中毒4。本文主要对麻痹性贝类毒素的作用机制、中毒症状、前处理方式、检测方法等方面进行阐述。1 麻痹性贝类毒素概述1.1 毒素的理化性质麻痹性贝类毒素是一种强极性的四氢嘌呤三环类化合物(结构见图 1),主要由石房蛤毒素(saxitoxin,STX)及其众多衍生物组成,包括新石房蛤毒素(neosaxitoxin,NEO)、膝沟藻毒素 1-5(gonyautoxins1-5,GTX1-5)、N-磺酰氨甲酰基毒素(N-sulfocarbamoyl gonyautoxin,C1
12、&2)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(decarbamoyl saxitoxin,dcSTX),脱氨甲酰基新石房蛤毒素(decarbamoyl neosaxitoxin,dcNEO),脱氨甲酰基膝沟藻毒素 2&3(decarbamoyl saxitoxin,dcGTX2&3)等,所有毒素具有相同的四氢嘌呤骨架,但官能团不同5,根据基团结构主要分为氨基甲酸酯类、N-磺酰氨甲酰基类、脱氨甲酰基类及脱氧脱氨甲酰基类等,其中氨基甲酸酯类的 STX 是主要成分,纯品为白色粉末,分子式为C10H17N7O4,分子量为 299.29。PSTs 易溶于水,部分溶于甲醇和乙醇,不溶于多数非极性有机溶剂,对酸稳定,不能被
13、人体消化酶破坏,在高浓度酸和碱性条件下易分解使毒性消失,对热稳定,高温不能失活6。1.2 毒素的毒理作用PSTs 是天然剧毒性毒素,其中 STX 的毒性与河豚毒素相当,是眼镜蛇毒性的 80 倍7,是一般麻醉剂毒性的 10 万多倍,人口服 0.5 1.0 mg 便可致死8。小鼠腹腔注射 STX 的半数致死剂量 LD50为 24 nmol/kg、灌 胃 LD50 为 1 237 nmol/kg9,人口服 LD50 为 5.7 g/kg,相当于摄入时致死剂量为0.57 mg10。世卫组织规定,可食用贝类中 PSTs 含量不高于 80 g/100g 贝肉(以 STX 计)11。PSTs 对电压门控钠通
14、道有高度亲和力,通过与通道位点相互作用,阻断神经细胞钠离子通道,动作电位传导阻滞,造成神经系统传输障碍,神经肌肉功能丧失而麻痹12-13。任晓虎等14通过同位素标记相对和绝对定量技术标记了染毒小鼠神经母细胞瘤 N2a 细胞的提取蛋白,进行 LC-MS/MS 分析,筛选出 4 种与 PSTs 神经毒性作用有关的蛋白:ABCB6、TES、TLR8、TIAM2,这些蛋白多与酶的催化和结合有关,可影响细胞的增值和凋亡,导致肌肉疼痛和神经麻痹。图1 主要的麻痹性贝类毒素的结构7Fig.1 Structures of major paralytic shellfi sh toxins7刑事技术Forens
15、ic Science and Technology4202023 年 第 48 卷 第 4 期毒 素 的 半 衰 期 长,STX 在 人 体 内 半 衰 期 有20.4 h15,不容易分解和排泄,易发生毒性反应16,发作多在 30 min 到几小时,中毒表现为口唇刺痛麻痹,逐渐扩散到颈面部、肢端,伴有头痛乏力、恶心呕吐、腹痛腹泻、吞咽困难、构音障碍、运动障碍等,还会出现反射减弱或消失、眼球震颤、瞳孔扩张等,严重者四肢抽搐、缺氧昏迷、呼吸停止、窒息死亡6,17-18,饮酒会加重症状19,对呼吸系统、神经系统和心血管系统有高特异性毒性,具有致癌、致畸、致突变的危害。1.3 毒素的转化与代谢PSTs
16、 在特定条件下可以发生相互转化,N-1 位的-OH、C-11 位的-OSO3H 在贝体内谷胱甘肽、半胱氨酸等还原剂作用下脱去,NEO 转化为了 STX,C1&2 转化为了 GTX5,相应的这些还原产物在贝体内、低 pH 和高温条件下又可逆地形成水解产物;R4 基团的氨甲酰基或 N-磺酰氨甲酰基在氨甲酰基水解酶作用下转化为相应的脱氨甲酰基类毒素,如膝沟藻毒素 GTX2&3 转化为脱氨甲酰基膝沟藻毒素dcGTX2&3 等;C-11 位脱去亚硫酸根,羟基化形成新型 M 毒素,如 C2 转化为 M1 等20。PSTs 在人体中毒的 3 4 h 内发生代谢转化,对各脏器组织中 PSTs 毒素进行检测,结
17、果显示尿液和胆汁中存在NEO 和 GTX4/GTX1,而胃内容物中不存在 NEO,表明毒素入体后,四氢嘌呤环中的 N1 位发生氧化,分别从 STX 和 GTX3/GTX2 差向异构体开始产生NEO 和 GTX4/GTX1 差向异构体,同时 STX 在肝、肾、肺中被检测到水解为 dcSTX,大部分毒素代谢发生在胃肠道和肝脏,并由尿液和粪便排出21-22。STX 和 NEO 是比较典型的 PSTs,常被作为相关中毒案件法医学诊断的生物标志物23。1.4 毒素的研究价值PSTs 在海洋生物学、神经生物学、医学、军事等领域都有研究价值24。由于 PSTs 的产生与赤潮有关,可以通过检测水体中 PSTs
18、 毒素的含量监测水体密度,判断微生物含量是否超标。STX 与钠离子通道蛋白的结合能力可以用来分析 Na+通道的数目、亲和力,分离纯化蛋白,推测氨基酸序列。PSTs 有麻痹、镇痛、降压等作用,可以用于麻醉类药物和抗癌类药物的开发,且没有成瘾性。由于 STX 的毒性极强,与神经毒气沙林的毒性相同,作用迅速且没有特效的解毒方法,因此已被列为化学武器受到管控。2 麻痹性贝类毒素的检测方法 在麻痹性贝类毒素中毒的实际检案中,既会涉及体内检材,也会涉及体外检材,目前体内检材中PSTs 的检测方法研究较少,主要集中在贝类样品中毒素的检测。2.1 前处理方法前处理方法包括沉淀蛋白法、液液萃取法和固相萃取法,其
19、中最简单的前处理方法是用乙腈、甲醇等沉淀蛋白,但灵敏度低,提取回收率低,基质效应高。液液萃取法回收率高,不需要特殊装置,但操作繁琐,难用于强极性物质的提取。固相萃取法常用于复杂样品提取和净化,萃取效率高,减少基质对样本的影响,回收率高,但操作费时,成本高,难以满足大批量样本的处理,对实验人员和仪器要求高。贝类基质中存在蛋白质、脂肪、色素和难以去除的黏液等成分,不同贝类样品基质本底差别大,由于 PSTs 极性强、水溶性,基质中的亲水性杂质对毒素检测的干扰能力强且难以去除,造成峰形差、灵敏度低、回收率低,单纯的沉淀蛋白法无法得到满意的结果,需要对样品进行浓缩净化处理,目前文献多采用液液萃取和固相萃
20、取结合来减小基质效应,降低检出限。2 2.1 1.1 1 固相萃取法 固相萃取法 因为 PSTs 易溶于稀酸,在碱性条件下会分解,所以一般采用酸性溶液进行提取,而乙酸萃取的回收率高于盐酸。卢丽明等25比较了用含 0.1%甲酸的 80%乙腈溶液提取后过 HLB 固相萃取小柱、用0.1%甲酸提取后 QuEChERS 净化管净化以及用0.1 mol/L 乙酸溶液超声提取后过 HLB 萃取柱这 3 种样品处理方法对贝类样品中的 PSTs 进行提取,结果表明前两种方法的回收率都低,而第三种方法回收率超过 80%。Huang 等26将贝类样品用 80%乙腈水溶液(含 0.1%甲酸)超声提取后,上清液冷冻分
21、离,保留水层用 0.1%甲酸水稀释,离心后上清液过活化好的 Oasis HLB 固相萃取柱,洗脱后用乙腈稀释过膜进样,准确度为 81.3%99.8%,RSD 值为2.02%5.36%。PSTs 的固相萃取常采用对极性物质有吸附作用的萃取柱,如石墨化炭黑固相萃取柱 ENVI-Carb,在 PSTs 检测中最常用。何明珠等27将 3 种贝类样品用 1%乙酸加热提取后,乙酸乙酯液液萃取,加4212023 年 第 48 卷 第 4 期入氨水调节 pH,过活化好的 Supelco ENVI-Carb 固相萃取柱,洗脱液离心取上清经 UPLC-MS/MS 检测,平均回收率达 92.2%144%,基质效应为
22、6.89%62.1%,灵敏度高,回收率高,重现性好。文献多以贝类作为提取基质,也有一部分报道是从人体生物样本中提取毒素。Xu 等23收集中毒者的尿液后,以一定比例的水/甲醇/乙腈(2 1 10)作提取溶剂,用 PA 柱固相萃取,UPLC-MS/MS 检测结果显示,STX 的回收率为 81.5%117%,NEO的回收率为 89%118%。国外也有实验对食品中的PSTs 毒素进行了检测,Jansson 等28开发了一种测定食物(包括水、牛奶、橙汁、苹果酱、婴儿食品和贻贝)中 PSTs 的新方法,将样品用甲醇/25 mmol/L NaOH(1 1)提取后,上清液过装载了二氧化硅和强阳离子交换硅胶键合
23、吸附剂 SCX 的 SPE 柱上,用 0.1 mol/L HCl 从硅胶 SPE 柱中洗脱 STX、NEO、dcSTX、dcNEO 和部分 GTX1-5、dcGTX2-3,用 0.5 mol/L 醋酸铵从 SCX 柱中洗脱更大部分的 GTX1-5、dcGTX2-3,洗脱液用乙腈稀释后进样分析,所有样品的回收率为 36%111%。2 2.1 1.2 2 分散固相萃取法 分散固相萃取法 与传统固相萃取相比,分散固相萃取具有操作简单快速、溶剂消耗小、成本低,可以减小基质效应干扰以及延长色谱柱使用寿命等优点。选择合适的吸附材料来净化样品基质,可以最大限度减少基质干扰。Yang 等29为提取贝类中的 P
24、STs,考察了不同的萃取溶剂,最终选择了 0.1%甲酸和 80%乙腈水溶液,得到很好的回收率,同时考察了 C18、石墨化炭黑 GCB、含两个氨基的乙二胺正丙基硅烷 PSA、活性炭 AC、酸性氧化铝 AlA 等吸附剂,最终选定了 C18+AlA 作为分散固相萃取的吸附剂,该方法的平均回收率达 81.52%116.5%,检出限 0.33 5.52 g/kg,定量限 1.32 11.29 g/kg,RSD 19.1%,回收率高、灵敏度高。2 2.1 1.3 3 免疫亲和层析法 免疫亲和层析法 免疫亲和层析法是利用抗原抗体特异性结合的原理提取目标物质的一种前处理方式。该方法选择性高,提取回收率高,基质
25、效应低。岳亚军等30制备了 STX 单克隆抗体的免疫亲和柱,用 11 种 PSTs的标准溶液过柱,超纯水淋洗,1%乙酸甲醇洗脱,55 氮吹后用初始流动相复溶,仪器检测结果表明,STX 在该柱子下几乎可以全部被洗脱,但该柱对 4种物质(NEO、dcNEO、GTX1、GTX4)没有亲和力,其余物质回收率可达 61.2%99.0%。2.2 麻痹性贝类毒素的分析检测技术由于麻痹性贝类毒素中毒发生范围广,毒性大,没有特效解毒剂,建立一种高效、快捷、准确、灵敏的检测方法尤为重要。基于麻痹性贝类毒素对热稳定、不易挥发的性质,不适用于气相色谱法,文献报道可见小鼠生物测定法、体外细胞毒性法、免疫分析法、高效液相
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