驴Zfy基因干扰载体的构建及验证.pdf
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1、第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.4Aug.2023收稿日期:2022-09-19 基金项目:山东省农业重大应用技术创新项目(SD2019XM008),新疆维吾尔自治区重点研发计划项目(2020B01002-2-1)作者简介:李梦雨(1996),女,硕士研究生,专业方向为动物遗传育种与繁殖研究。通信作者:贾斌(1965),男,教授,从事动物遗传育种与繁殖研究,e-mail:jiabin 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.202
2、3.22.033文章编号:1007-7383(2023)04-0435-06 驴 Zfy 基因干扰载体的构建及验证李梦雨1,孙玉江2,李超程1,吕毅航1,范洪先3,郑新宝3,肖海霞3,贾斌1(1 石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832003;2 青岛农业大学生命科学学院,山东 青岛 266109;3 新疆畜牧科学院畜牧研究所,新疆 乌鲁木齐 830000)摘要:目的 探讨干扰驴 Zfy 基因的体内外干扰效果。方法 根据驴 Zfy 基因设计合成 4 段 shRNA,并由独立的 U6 启动子启动,每两个 shRNA 片段串联组合成干扰载体,体外培养生精细胞检测干扰载体的干扰效率,筛选最佳的干
3、扰载体用于体内验证干扰效果。结果 结果显示:构建出 2 个驴 Zfy 基因双 shRNA 串联重组干扰载体 CV250-1、CV250-2,细胞水平验证结果表明 CV250-1 的干扰效率为 76.37%6.36%,差异极显著(P0.01);CV250-2 的干扰效率为 67.73%4.94%,差异显著(P0.05)。成功对 CV250-1 重组载体进行体内验证,经母体静脉血胎儿游离DNA 性别鉴定得到胎儿雌性率为 71.05%(P0.05)。结论 成功构建的驴 Zfy 基因重组载体 CV250-1,可抑制种公驴睾丸组织 Zfy 基因的表达,细胞水平干扰效率为 76.37%,体内试验胎儿雌性率
4、为 71.05%,差异显著(P0.05)。关键词:驴;Zfy 基因;串联干扰载体;性别控制中图分类号:S822文献标志码:AConstruction and verification of Zfy gene interference vector in donkeyLI Mengyu1,SUN Yujiang2,LI Chaocheng1,LYU Yihang1,FAN Hongxian3,ZHENG Xinbao3,XIAO Haixia3,JIA Bin1(1 Shihezi University,College of Animal Science and Technology,Shihe
5、zi,Xinjiang 832003,China;2 Qingdao Agricultural University,College of Life Science,Qingdao,Shandong 266109,China;3 Institute of Animal Science,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinjiang 830000,China)Abstract:Objective To explore the effect of interfering Zfy gene in donkey in vitro and in vi
6、vo.Method Four segments of shRNA were designed and synthesized according to the donkey Zfy gene,and were initiated by an independent U6 promoter.Each 2 shRNA seg-ments were combined in series to form an interference vector.The spermatogenic cells were cultured in vitro to detect the interference eff
7、iciency of the tandem interference vector,and the best ones were screened.Tandem interference vectors were used to verify the inter-ference effect in vivo.Results The results showed that two donkey Zfy gene double shRNA tandem recombinant interference vectors CV250-1 and CV250-2 were constructed.The
8、 results of spermatogenic cell level verification showed that the interference efficiency of CV250-1 was 76.376.36%,and the difference was extremely significant(P0.01);the interference efficiency of CV250-2 was 67.734.94%,and the difference was significant(P0.05).The CV250-1 recombinant vector was s
9、uccessfully verified in vivo,and the fetal female rate was 71.05%(P0.05)through the identification of fetal cell-free DNA in maternal venous blood.Conclusion The constructed donkey Zfy gene recombinant vector CV250-1 can inhibit the expression of Zfy gene in the testis tissue of male donkeys.The int
10、erference efficiency at the cellular level is 76.37%,and the fetal female rate in the in vivo test is 71.05%,with significant differences(P0.05).Key words:donkey;Zfy gene;tandem interference vector;sex control阿胶和驴乳产业的飞速发展,使驴皮和驴乳出现供不应求的现状,驴繁殖力低成为制约驴产业发展最直接的问题1。因此,研究驴的性控技术,扩大繁殖母驴数量,实现高效快速扩繁种群,定向培育母畜群体
11、势在必行。睾丸决定因子 TDF(testis-determining factor)的436 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷发现,使胚胎阶段的性别分化成为研究热点。研究发现在 Y 染色体短臂上存在可以调控精细胞转化为精子的基因2,分别是睾丸决定因子 SRY、精原细胞增殖因子 Eif2s3y3和影响精子成熟的转录因子Zfy24。多种研究表明,Zfy 基因是 C2H2 锌指蛋白转录因子(ZNFs)的家族成员之一,当敲除 Zfy 的双等位基因发现细胞生长和增殖出现缺陷5。随后研究发现,Zfy 基因通过“锌指”结构域来调控其他基因的表达,影响精子的发生过程6。RNAi 技术作为疾病靶向基因治
12、疗的新手段,已被用于各种疾病的治疗。应用 RNAi 技术沉默 Zfy 基因表达,使精子在生精阶段相关基因表达量变化,从而影响 Y 精子活力、畸形率等,Y 精子与卵子结合的几率降低,而 X 精子不受影响,从而达到精子发生阶段控制性别的目的。本研究应用 RNAi 技术针对驴 Zfy 基因编码区设计 RNA 干扰片段,构建 shRNA 串联载体,通过睾丸注射技术,干扰 Zfy 基因表达,使精子在发生阶段Zfy 基因表达下降,从而影响 Y 精子的发育,降低受精几率,最终实现多产母驴的目标。为快速扩繁种群提供理论依据。1 材料与方法1.1试验试剂及仪器无内毒素质粒大提试剂盒、血液基因组 DNA 提取试剂
13、盒(北京天根生化有限公司);胎牛血 清、DMEM/F12(美国 Gibco 公司);胰岛素、FSH、睾酮、视黄酸、转铁蛋白、胶原酶、透明质酸酶、维生素A、C、E(美国杰华科技有限公司);丙酮酸、胰蛋白酶、DNase(北京索莱宝科技有限公司);脂质体 2000(invitrogen);TBGreen PremixExTaqTM(TaKaRa);QI Aamp DNA Mini and Blood Mini Hand book(凯杰生物工程有限公司)。核酸蛋白检测仪(德国 Thermo 公司);荧光定量 PCR 仪(美国 Bio-Rad 公司)。1.2试验动物驴睾丸组织采自新疆石河子九昌驴业有限公
14、司屠宰的青年健康新疆驴新鲜睾丸。种公驴、空怀母驴由新疆喀什泽普县金胡杨牧业有限公司提供,6 头 46 岁青年健康德州公驴,若干头经产健康新疆母驴。经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准,伦理批准号分别为2020-051-01、2019-061-01,自觉遵守试验动物福利伦理原则,保障动物福利及安全。1.3主要试验方法1.3.1设计 shRNA 序列根据 NCBI 提供 的驴 Zfy 基 因 与 Zfx 基 因 的CDS 区序列,选择两者碱基差异较大区域设计 4 段siRNA。分别添加 loop(颈环)、靶点反义序列及终止密码子合成 shRNA 干扰片段,为每段 shRNA 添加 U6
15、 启动子。将设计好的序列交由上海吉凯生物技术有限公司合成。siRNA 序列信息如表 1 所示。表 1siRNA 序列信息片段名称序列siRNA-AGAGGATGACTTGGGTGGTAsiRNA-BTAGATATCGTGGAGAGTGAsiRNA-CGGATACAGAGTTGGAAATTsiRNA-DGATGGTTCGTCTGGAATGA1.3.2构建 shRNA 串联干扰载体选择 4.7 kb 质粒载体 CV250,将合成好的 shR-NA 片段与载体重组,构建 CV250-2shRNA 串联干扰载体,并分别命名为 CV250-1、CV250-2。shRNA序列和串联载体构建如图 1 所示。
16、图 1shRNA 序列和 CV250-2shRNA 串联载体构建第 4 期李梦雨,等:驴 Zfy 基因干扰载体的构建及验证437 1.3.3细胞水平验证串联干扰载体采集成熟驴睾丸组织,采用两步酶消化法分离出睾丸支持细胞和生精细胞,并放入完全培养液7中在 35 、5%CO2、湿度为 95%的条件下培养 24 h,用脂质体 2 000 作为转染试剂将 1.3.2 中保存的载体转染到生精细胞中,每组重复 3 次。转染 58 h后提取生精细胞的总 RNA,设计 qRT-PCR 引物,以驴 GAPDH 基因为内参基因,以重组载体转染的细胞为试验组,未进行转染的细胞为对照组,检测重组串联干扰载体转染生精细
17、胞后,Zfy 基因的相对表达量,计算重组串联干扰载体的干扰效率,选择高效重组串联干扰载体。试验所用引物如表 2 所示。表 2Zfy、Zfx、GAPDH 引物设计序列引物名称序列片段长度/bp退火温度/扩增长度/bpZfyF:CCTGTGGAGCAGCAAGATGACAAA24R:CATGGTCATTCCAGACGAACCATCC2560105ZfxF:GATGCAACAGGAGCTGATGCTACA24R:CTGAGTCTGGGTCATCAGGAACAAAG2660136GAPDHF:GCGATGCTGGTGCTGAATATGTTG24R:GCAGAAGGAGCAGAGATGATGACC246
18、01151.3.4体内验证串联干扰载体将 1.3.3 中经细胞水平筛选的高效重组载体CV250-1 用于动物体内干扰试验。根据驴睾丸体积使用睾丸注射法将质粒注射进入驴睾丸组织中,共注射 3 针,每隔 10 天注射 1 次,每头驴每侧睾丸每次注射 3 mg 质粒,第 3 针结束后间隔 6 天进行人工授精。因驴的妊娠期时间约 365 d,妊娠周期较长。因此,为加快试验进程,参照前人的研究7,选择 18 周孕驴外周静脉血血浆进行胎儿游离 DNA 性别鉴定,统计后代性别,得到重组干扰载体干扰后代的雌性率。设计牙釉蛋白引物,以对照组(阳性对照:种公驴 DNA;阴性对照:空怀母驴 DNA)和试验组(怀孕母
19、驴)的胎儿游离 DNA 为模板,进行 PCR 扩增及电泳检测。牙釉蛋白引物见表 3。表 3AMEL 引物序列信息基因名称引物序列退火温度/阴性对照/bp阳性对照/bpAMELF:AGTTCCTGGCCAACACTCR:GCTGGCCAAGCTTCCAGA582372372221.4数据处理与统计分析本试验采用 Excel 整理初始数据,qRT-RCR 数据采用 2-CT进行计算,采用 SPSS 26.0 软件对数据进行单因素方差分析(AVONA),统计结果以平均数标准误(MeanSD)表示,“”表示(P0.05)差异显著,“”表示(P0.01)差异极显著。2 结果与分析2.1shRNA 串联干
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