粮食中二甲戊灵的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究.pdf
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1、粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第4期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工农药残留(Pesticide residues)是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。施用于作物上的农药,其中一部分粮食中二甲戊灵的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究李紫云
2、1,黄熙荣2,黄伟2,黄文杰1,刘珊珊2,孙秀兰3,丁丽4,肖理文4(1.中储粮广州质检中心有限公司广西分公司,南宁530200;2.江苏省粮油质量监测中心,南京210000;3.江南大学,江苏 无锡214122;4.南京微测生物科技有限公司,南京210031)摘要:粮食中二甲戊灵残留分析方法多为大型仪器检测,检测结果准确,但存在操作复杂、设备价格昂贵等问题,旨在建立一种基于免疫层析技术来检测粮食中二甲戊灵检测方法。通过研究,成功研制出一种选用时间分辨荧光微球为载体,利用二甲戊灵抗原抗体特异性反应来进行检测的快速定量检测卡,并摸索出二甲戊灵快速定量检测卡的最佳标记工艺为羊抗鼠抗体-145198
3、 nm微球-二甲戊灵抗体组合标记方案,最佳划膜液为PBS与CBS体系划膜液,最佳样品垫为GL0194与JL80,最佳样品稀释液体系为BBS体系。并对检测卡进行性能检测,得出其最低检出限为7.516 g/kg,最低定量限为19.873 g/kg,检测灵敏度高,可用于粮食中二甲戊灵的快速定量检测。关键词:时间分辨荧光微球;二甲戊灵;快速检测;特异性反应;检出限中图分类号:TS 210.7文献标识码:A文章编号:1007-6395(2023)04-0158-07Research Progress on Pendimethalin QuantitativeDetection Card in Grain
4、 Based on Time-Resolved Fluorescence MicrospheresLI Ziyun1,HUANG Xirong2,HUANG Wei2,HUANG Wenjie1,LIU Shanshan2,SUN Xiulan3,DING Li4,XIAO Liwen4(1.Guangxi Branch,China Grain Storage Guangzhou Quality Inspection Center Co.,Ltd.,530200 Nanning,China.2.Jiangsu Grain and Oil Quality Monitoring Center,21
5、0000 Nanjing,China.3.Jiangnan University,214122 Wuxi Jiangsu,China.4.Nanjing Micro Measurement Biotechnology Co.,Ltd.,210031 Nanjing,China)Abstract:Most of the analysis methods of Pendimethalin in grain are large-scale instrument detection methods.The detection results are accurate,but there are som
6、e problems such as complex operation and expensive equip鄄ment.This study aims to establish a detection method for Pendimethalin in grain based on immunochromatogra鄄phy.Through the research,a rapid quantitative detection card using time-resolved fluorescent microspheres asthe carrier and the specific
7、 reaction of Pendimethalin antigen and antibody was successfully developed.It wasfound that the best marking process of Pendimethalin rapid quantitative detection card was combined Sheep antimouse antibody and 145198 nm microspheres and Pendimethalin antibody,the best cutting solution was PBSand CBS
8、 system,and the best binding pad was GL0194 and JL80,and the best sample dilution liquid is BBSsystem.The performance of the detection card is tested,and the minimum detection limit is 7.516 g/kg,theminimum quantitative limit is 19.873 g/kg,with high detection sensitivity,which can be used forPendim
9、ethalin rapid quantitative detection in grain.Key words:time-resolved fluorescent microspheres,pendimethalin,quick test,specific reaction,detection limit收稿日期:2023-04-17作者简介:李紫云(1977-),女,助理工程师,研究方向:食品质量安全、粮食仓储与检验。通信作者:肖理文(1983-),男,中级职称,硕士,研究方向:食品安全快速检测。附着于作物上,一部分散落在土壤、大气和水等环境中,环境残存的农药中的一部分又会被植物吸收。残留农
10、药直接通过植物果实或水、大气到达人、畜体内,或通过环境、食物链最终传递给人、畜。食用含有大量高毒、剧毒农药残留的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品,虽然不会导致急性中毒,但可能引起人的慢性中毒,导致疾158粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第4期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加
11、工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工病的发生,甚至影响到下一代。二甲戊灵(pendimethalin)是农药的一种,又名二甲戊乐灵,分子式为C13H19N3O4,分子量为281.3,其性质不易溶于水,易溶于丙酮、二甲苯等绝大多数有机溶剂,是我国比较常用的二硝基甲苯胺类除草剂1,按我国农药毒性分级标准判断,二甲戊灵属低毒类除草剂,主要作用是抑制分生组织细胞分裂,但不影响杂草种子的萌发。二甲戊灵还能有效地抑制烟草的腋芽发生,提高烟叶的产量和改善烟叶的品质。但二甲戊灵残留量超标依旧会对人体产生影响。近年来,稻谷、糙米、大米等农作物以及瓜果蔬菜中经常被
12、报道二甲戊灵残留量超标2-6,人们对二甲戊灵的分析研究也日渐增多。我国GB 27632021食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量 中规定粮食谷物中二甲戊灵的最大残留限量标准为0.1 mg/kg(糙米、玉米)8,常用于二甲戊灵残留分析的主要方法有高效液相色谱法、固相萃取-气相色谱-质谱法、毛细管气相色谱法等,这些分析方法灵敏度高,结果准确,但操作复杂,仪器设备价格昂贵9-12。本文旨在研制出一种基于时间分辨荧光微球为载体,利用二甲戊灵抗原抗体特异性反应进行检测快速定量检测卡,具备快速、简便、定量检测等优点,同时价格低廉、性价比高。1实验材料1.1实验所用原辅料除注明外,试剂均为分析纯,试验用
13、水均为UP水。二甲戊灵抗原抗体、时间分辨荧光纳米微球购自上海飞测;羊抗鼠IgG、ProteinA、抗DNP-DNP购自北京博尔西;碳二亚胺(EDC)购自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)购自默克;硝酸纤维素膜(NC膜)购自赛多利斯;样品垫和吸水纸均购自上海金标;二甲戊灵的标准品(100g/ml)购自Sigma公司;其它常规化学试剂均购自国药集团;大米、玉米、小麦等样品购自超市。1.2实验所用仪器设备高速冷冻离心机购自上海卢湘仪;旋涡混匀器购自海门市其林贝尔;电子天平购自Sartorius;移液枪购自赛多利斯;喷金划膜仪购自杭州峰航;荧光免疫分析仪与检测卡恒温孵育器购自上海飞测生物。2实验反
14、应原理采用时间分辨荧光免疫层析法,利用二甲戊灵抗原抗体的免疫反应原理实现检测,先在荧光微球上偶联一种二抗,再偶联上二甲戊灵抗体,形成微球-二抗-二甲戊灵的结合体,NC膜上包被二甲戊灵合成抗原(检测线T线)和二抗(参考线C线)。当样品滴加在检测卡加样孔时,样品中二甲戊灵抗原会先与荧光微球表面的二甲戊灵抗体特异性结合,再层析经过NC膜,在NC膜上,荧光微球偶联剩余未结合的二甲戊灵抗体先与NC膜上二甲戊灵-BSA合成抗原结合,继续层析,样品中二甲戊灵抗原已与荧光微球偶联二甲戊灵结合抗体与NC膜上二抗结合,使用荧光免疫分析仪读取NC膜上C、T线荧光值,参考线C线荧光值随检测线T线荧光值的降低而升高。3
15、检测卡的组成3.1二甲戊灵结合垫将二抗以120 g/mL的标记量、二甲戊灵抗体10100 g/mL的标记量与200400 nm的时间分辨荧光纳米微球进行偶联,偶联时间为0.52 h;随后用微球稀释液将其以1050倍的稀释倍数进行稀释,用喷金划膜仪以28 l/cm的量喷涂在样品垫上,于37 加速稳定2472 h,保存备用。3.2二甲戊灵大卡用喷金划膜仪将二抗以0.11 mg/mL的划膜浓度0.51 L/cm包被在140 NC膜距下端15 mm处,将二甲戊灵抗体以0.12 mg/mL的划膜浓度0.51 L/cm包被在140 NC膜距下端10 mm处,于37 加速稳定2472 h,保存备用。3.3二
16、甲戊灵检测卡在长8 cm的PVC底板上,依次搭接样品垫、二甲戊灵结合垫、划有C/T线的NC膜和吸水纸,切成4 mm宽的细条,放入卡壳中压紧,装入铝箔袋,每包加入1包1 g的干燥剂,密封保存备用。4关键溶液配制4.1划膜液10 mM PBS、10 mM CBS、10 mM MES、10 mM体系,含有0.1%1%的氯化钠,1%5%的糖类与0.1%0.5%的防腐剂。4.2样品稀释液50 mM PBS、50 mM Tris-HCl、50 mM CBS、50mM BBS体系,pH调节为8.00.2,含有1%2%的氯化钠,1%3%的糖类,1%2%的BSA,0.5%3%的表面活性剂与0.1%0.5%的防腐
17、剂。5实验步骤5.1前处理步骤将粮食样品先进行粉碎过筛,称取5.0 g样品与80%甲醇提取液按照13110的比例进行提取,159粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第4期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工JL80,RB65,GL0194作为喷金样品垫进行喷金检测。在空白玉米与空白小麦样品中添加二甲戊灵低中标准品50 g/kg、200
18、 g/kg这2个浓度点,并进行提取稀释检测,每个浓度点检测3个平行样,检测结果见表3。乳胶在不同样品垫上的形态如图1所示。从表3平均变异系数数据可知,GL0194平均CV为8%;JL80平均CV为9%;SB08平均CV为10%;RB65 CV为13%,样品垫选择依次为GL0194优于JL80优于SB08优于RB65。玉米样品的平均从表2测试结果可知:145 nm微球检测20 g/kg抑制率为22.75%;198 nm微球检测20 g/kg抑制率为21.75%;两种微球检测20 g/kg灵敏度较298 nm与400 nm微球更高,且从201000g/kg检测抑制率分布来说,145nm与198nm
19、微球均较优。6.1.3不同样品垫对样品均一性检测影响根据表1与表2的检测结果,选用羊抗鼠IgG-羊抗鼠IgG C线体系,198 nm微球进行检测卡制备与下一步优化。选用4种不同材质样品垫SB08,198 nm、298 nm、400 nm微球进行标记检测。在提取液中添加二甲戊灵低、中、高浓度标准品0 g/kg、20g/kg、200 g/kg、1 000 g/kg这4个浓度点,并与样品稀释液稀释检测,每个浓度点检测2个平行样,检测结果见表2。6.1.2不同微球粒径对灵敏度检测影响根据表1检测结果,选用羊抗鼠IgG-羊抗鼠IgG作为C线体系,用羊抗鼠IgG-二甲戊灵抗体与微球标记稀释喷金成二甲戊灵结
20、合垫,用羊抗鼠IgG、二甲戊灵合成抗原包被划膜成参考线C线与检测卡T线,组成二甲戊灵大卡。分别选用145 nm、4.7351.5380.5823.3963.6883.2957.07754.37727.66611.086表1不同C线体系的灵敏度C线体系ProteinA-羊抗鼠羊抗鼠-羊抗鼠自身鼠抗-羊抗鼠DNP-抗DNP添加标准品浓度(g/kg)T/C抑制率/%T/C抑制率/%T/C抑制率/%T/C抑制率/%026.41415.8003.2182020.23514.9205.572.70415.952009.59512.98617.811.57451.091 0004.4146.64957.92
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