桔梗多糖的复合酶提取、结构表征及抗氧化活性分析.pdf
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1、李卫,房雷雷,张彦青,等.桔梗多糖的复合酶提取、结构表征及抗氧化活性分析 J.食品工业科技,2023,44(18):283291.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120100LI Wei,FANG Leilei,ZHANG Yanqing,et al.Compound Enzyme Extraction of Platycodon grandiflorum Polysaccharides and ItsStructure and Antioxidant Activity CharacterizationJ.Science and Technology of F
2、ood Industry,2023,44(18):283291.(in Chinesewith English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120100 工艺技术 桔梗多糖的复合酶提取、结构表征及桔梗多糖的复合酶提取、结构表征及抗氧化活性分析抗氧化活性分析李卫1,房雷雷1,张彦青1,*,解军波2,*(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134;2.天津中医药大学中药学院,天津 301617)摘要:目的:优化复合酶法提取桔梗多糖工艺,并初步分析桔梗多糖的结构和体外抗氧化活性。方法:分别考察酶添加量、料液比、酶解时间、酶解温
3、度对桔梗多糖提取率的影响,采用响应面法进行提取条件优化,利用高效液相色谱法(HPLC)测定多糖的分子量和单糖组成,应用核磁共振(NMR)和扫描电镜(SEM)对多糖的糖苷键和形貌进行分析,并对多糖清除自由基的能力和还原力进行研究。结果:桔梗多糖的最佳提取工艺为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的添加量为 2%,酶解时间 90 min,料液比 1:30 g/mL,酶解温度 50,在此条件下,多糖实际提取率为 9.01%0.07%,多糖含量达 92%0.76%。纯化后得到桔梗多糖组分 PGP-W-1,分子量为 6.2 kDa,由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖按照摩尔比 4.9:4.3:7.
4、9:7.8:4.8:18.6 组成,是一种具有 型糖苷键和 型糖苷键的吡喃型多糖。体外抗氧化试验显示 PGP-W-1 对 DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟基自由基清除率 IC50值分别为 2.14、2.25、0.78 mg/mL。结论:本研究优选出的桔梗多糖提取工艺切实可行,多糖提取效率高并表现出良好的体外抗氧化活性。关键词:桔梗多糖,提取工艺,复合酶,结构分析,抗氧化活性本文网刊:中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:10020306(2023)18028309DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120100CompoundEnzymeExt
5、ractionofPlatycodongrandiflorumPolysaccharidesandItsStructureandAntioxidantActivityCharacterizationLIWei1,FANGLeilei1,ZHANGYanqing1,*,XIEJunbo2,*(1.College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China;2.School of Chinese Materia Medica,Tianjin University of T
6、raditional Chinese Medicine,Tianjin 301617,China)Abstract:Objective:Optimize the extraction process of Platycodon grandiflorum polysaccharides by compound enzymemethod,and preliminarily analyze its structure and in vitro antioxidant activity.Methods:Response surface methodologywas used to optimize t
7、he extraction conditions with the extraction rate of polysaccharides as the index and the additionamount of enzymes,solid-liquid ratio,enzymolysis time and enzymolysis temperature as the factors.The molecular weightand monosaccharide composition of purified polysaccharides were analyzed by high perf
8、ormance liquid chromatography(HPLC),the glycosidic bonds and surface morphology of purified polysaccharides were analyzed by nuclear magneticresonance (NMR)and scanning electron microscopy (SEM),respectively,and the free radical scavenging ability andreducing power of purified polysaccharides were e
9、valuated.Results:The optimum extraction conditions were as follows,收稿日期:20221212 基金项目:国家自然科学基金(82073989);天津市“131”创新型人才团队(201927)。作者简介:李卫(1998),男,硕士研究生,研究方向:药食同源物质研究与开发,E-mail:。*通信作者:张彦青(1976),女,博士,教授,研究方向:食品、药品营养功能开发和农副产品高值化综合利用,E-mail:。解军波(1975),男,博士,教授,研究方向:药食同源物质的开发与评价,E-mail:。第 44 卷 第 18 期食品工业科技
10、Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 the addition of cellulase,pectinase and papain was 2%,the enzymolysis time was 90 min,the solid-liquid ratio was1:30 g/mL,the enzymolysis temperature was 50.Under these conditions,the actual extraction rate of polysaccharideswas 9
11、.01%0.07%,and the purity of polysaccharides was 92%0.76%.The purified polysaccharides component PGP-W-1(6.2 kDa)was composed of mannose,rhamnose,glucose,galactose,xylose,and arabinose with a molar ratio of4.9:4.3:7.9:7.8:4.8:18.6.NMR spectrum showed that PGP-W-1 was pyranose ring with-and-glycoside
12、bond.TheIC50 values of the PGP-W-1 on DPPH free radicals,ABTS+free radicals and hydroxyl free radicals were 2.14,2.25,and0.78 mg/mL,respectively.Conclusion:The optimized extraction process of Platycodon grandiflorum polysaccharide wasfeasible with high extraction efficiency and showed excellent anti
13、oxidant activity in vitro.Keywords:Platycodon grandiflorum polysaccharides;extraction process;compound enzyme;structure characterization;antioxidant activity 桔梗,又名土人参,是属于双子叶植物纲、桔梗科、桔梗属的多年生草本植物1,广泛分布于我国的四川、广西、贵州、陕西等地。桔梗味苦、性平,具有丰富的食用和药用价值,其主要成分有多糖、皂苷、黄酮、挥发油等2,其根可入药,有宣肺排脓、止咳祛痰等作用3。桔梗多糖富集于桔梗根部细胞中4,作为桔梗中
14、重要的生物活性物质之一5,桔梗多糖在抗肿瘤6、抗氧化7、增强免疫8以及降血糖9等方面都发挥着重要作用。桔梗根部细胞及木质层主要由纤维素、木质素构成10,细胞内层和细胞壁中还含有大量果胶11,传统的回流提取方法难以剔除其中粗纤维、蛋白质和胶质等杂质12,不利于多糖高效提取。复合酶法提取作为一种新型提取工艺,其提取条件温和,提取效率高,将相应的生物酶混合使用能有效破坏植物细胞壁13,分解纤维素、蛋白质和果胶等杂质,从而提高多糖溶出率。针对桔梗根结构特点,本实验选用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶进行配比组合,通过单因素实验和响应面法优化建立了一种新型复合酶法提取桔梗多糖的工艺。在此基础上,对所提取的桔
15、梗粗多糖分离纯化,并对纯化后的多糖组分进行结构和抗氧化活性的初步分析,以期为桔梗多糖的高效提取及其进一步深入研究提供参考。1材料与方法 1.1材料与仪器桔梗根河北安国中药材交易专业市场;1,1-二苯基-2-三硝基肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、磷酸钠、钼酸铵分析纯,天津市鼎盛鑫化工有限公司;纤维素酶(50 U/mg)、果胶酶(500 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)分析纯,上海源叶生物科技有限公司。TDA-8002 型恒温水浴锅天津市中环实验电炉有限公司;Heraeus Megafuge 8R 型离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公
16、司;SpectraMax-M5 型多功能读板机美国 Molecular Devices 公司;Agilent 1100Series 高效液相色谱仪美国 Agilent 公司;Alltech3300 ELSD 检测器美国 Grace 公司;HT7700 透射电子显微镜日本 Hitachi 公司。1.2实验方法 1.2.1 桔梗预处理将购买的新鲜桔梗根在阳光下晾晒三日,粉碎过 60 目筛后,以石油醚为提取剂,80 水浴下回流 3 h,干燥滤渣得脱脂桔梗粉末,收集进行后续多糖提取。1.2.2 单一酶的最适添加量实验固定酶解温度 50,时间 60 min,料液比 1:25 g/mL,以多糖得率为指标,
17、选择木瓜蛋白酶、纤维素酶以及果胶酶按照质量比为 0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%进行实验。1.2.3 复合酶配比正交试验根据单一酶实验结果,以多糖得率为指标,进行正交试验筛选最佳复合酶配比,因素水平见表 1。表 1 正交试验因素水平设计Table 1 Orthogonal experimental factor horizontal design水平X:纤维素酶(%)Y:果胶酶(%)Z:木瓜蛋白酶(%)11.51.512221.532.52.52 1.2.4 复合酶提取工艺单因素实验结合筛选出最佳的复合酶比例,从影响多糖得率的因素中选取酶解温度(30、40、50、60、70)、料液比(
18、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL)、酶解时间(30、60、90、120、150 min),对复合酶法提取桔梗多糖进行单因素优化实验,其中各因素固定水平为酶解温度 50,酶解时间 60 min,料液比 1:25 g/mL。1.2.5 复合酶提取工艺响应面优化试验为了继续优化桔梗多糖的复合酶法提取工艺,结合单因素实验的结果,选取酶解温度(A)、料液比(B)、酶解时间(C)为影响因素,以多糖得率为指标进行三因素三水平的响应面试验设计,因素水平如表 2。表 2 响应面试验因素水平设计Table 2 Experimental factor level of response s
19、urface水平A:酶解温度()B:料液比(g/mL)C:酶解时间(min)1401:25600501:30901601:35120 1.2.6 桔梗多糖的含量及得率计算多糖的含量测 284 食品工业科技2023 年 9 月定采用苯酚-硫酸比色法14。以葡萄糖标准液浓度为横坐标,OD620 nm为纵坐标,得到葡萄糖标准曲线:y=0.0438x0.0052,R2=0.9993。桔梗多糖得率计算公式为:多糖提取得率(%)=M1M2/M3100式中:M1为桔梗多糖质量,g;M2为桔梗多糖含量,%;M3为桔梗粉末质量,g。1.2.7 桔梗多糖的分离纯化配制使用 5 mg/mL 的多糖溶液,经 0.22
20、 m 微孔滤膜过滤后,采用 DEAE-Sepharose Fast Flow 和 Sephacryl S-300 层析柱对桔梗粗多糖进行分离纯化,苯酚-硫酸比色法监测多糖含量,绘制洗脱曲线。合并主峰洗脱液,透析冻干后即得纯化多糖组分。1.2.8 桔梗多糖分子量测定通过 HPLC-ELSD 法计算桔梗多糖分子量15。色谱条件:Agilent 1100Series 高效液相色谱仪,Alltech 3300 ELSD 检测器;色谱柱:Agilent PL aquael-OH Mixed-H 柱(4.60 mm150 mm,8 m);流动相为超纯水;进样量 20 L。1.2.9 桔梗多糖单糖组成测定采
21、用 PMP 柱前衍生化法结合 HPLC 测定单糖组成16。具体步骤为:取 200 L 质量浓度为 4 mg/mL 的多糖溶液,加入100 L 三氟乙酸(4 mol/L)溶液,N2封管,于 110 烘箱中水解 2 h。水解完成后,加入 400 L 甲醇于70 条件下用 N2吹干,重复 3 次以去除三氟乙酸。加入 100 L NaOH(0.3 mol/L)溶解残渣,再加入 100 L 的 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液于 70 孵育 60 min。冷却至室温后,加入 100 L 的 0.3 mol/LHCl 溶液调节 pH。使用超纯水定容至 2 mL,再加入 2 mL 氯仿进行萃取,保留上层
22、水相,经 0.22 m滤膜过滤后进样分析。色谱条件:Agilent 1100 Series高效液相色谱仪,DAD 检测器;色谱柱:Hypersl OD25 柱(4.60 mm250 mm,5 m);柱温 27;流速0.9 mL/min;流动相:0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(pH6.8)-乙腈(84:16);检测波长 250 nm;进样量20 L。比较样品与混合标准单糖图谱,确定单糖组成和含量。1.2.10 桔梗多糖核磁共振分析25 mg 桔梗多糖溶解于0.6 mL D2O 中,然后用Bruker AscendTM 600 NMR核磁共振仪记录1H 和13C 光谱。MestNova 软件
23、用于数据分析。1.2.11 桔梗多糖的扫描电镜观察取少量干燥多糖,经电流镀金后使用 HT7700 透射电子显微镜测定并拍照,在 1000、2000 和 5000 倍下观察其表面形态。1.2.12 桔梗多糖体外抗氧化活性分析 1.2.12.1 总还原力测定根据 Chen 等17的方法稍作修改。取 pH 6.6 浓度为 0.2 mol/L 的 H3PO4盐缓冲液 2.5 mL,与 1 mL 浓度为 10 mg/mL 的 K3Fe(CN)6混合。在混合液加入不同浓度的桔梗多糖溶液,50 下反应 20 min 后,加入 1.0 mL 10%的 Cl3CCOOH溶液,离心分离。取上层清液 2.5 mL,
24、加入 2.5 mL去离子水和 2.5 mL 0.1%的 FeCl3,混合后,测定吸光度 A(700 nm)。维生素 C 为阳性对照组,蒸馏水为空白对照组。1.2.12.2 DPPH 自由基清除能力根据 Wang 等18的方法稍作修改。取 2.0 mL 桔梗多糖溶液与 3.0 mLDPPH-乙醇溶液(7 mmol/L)混合。混合液在黑暗条件下静置 30 min,然后在 517 nm 处测定吸光度,记为 A1;以乙醇替代多糖溶液测得的吸光度记为 A0;蒸馏水代替 DPPH-乙醇溶液测得吸光度为 A2;维生素 C 作为阳性对照组,桔梗多糖的 DPPH 自由基清除能力为:DPPH自由基清除率(%)=(
25、1(A1A2)/A0100 1.2.12.3 ABTS+自由基清除能力根据施利奇等19的方法稍作修改。将 5 mmol/L 过硫酸钾溶液与7 mmol/L ABTS 溶液等体积比例混合,并在室温静置过夜。使用蒸馏水稀释混合液,直至 734 nm 波长下吸光度达到 0.700.02。将桔梗多糖溶液与 4 mL配制好的 ABTS 溶液混合,反应 6 min 后,测量反应后的吸光度 A1(734 nm)。以蒸馏水替代多糖溶液测得的吸光度记为 A0。以蒸馏水替代 ABTS 溶液测得的吸光度记为 A2。维生素 C 作为阳性对照组,桔梗多糖的 ABTS+自由基清除能力计算公式为:ABTS+自由基清除率(%
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