基于BSA-seq和RNA-seq挖掘水稻株高相关QTL.pdf
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1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):173-184收稿日期:2023-04-22基金项目:海南省自然科学基金项目(2021JJLH0075),国际(地区)合作与交流项目(32261143465),海南省重点研发项目(ZDYF2022XDNY260),国家自然科学基金项目(31970237),辽宁省自然科学基金面上项目(2022-MS-309),沈阳师范大学“百人计划”拔尖人才项目(SSDBRJH2002012),沈阳师范大学重大项目孵化工程(ZD202104),省级大学生创新创业训练计划资助项目(S202310166005)作者简介:吴元明,男
2、,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:通讯作者:逄洪波,女,博士,副教授,研究方向:植物逆境分子生物学;E-mail:基于 BSA-seq 和 RNA-seq 挖掘水稻株高相关 QTL 吴元明1 林佳怡1 柳雨汐1 李丹婷2 张宗琼2 郑晓明3,4,5 逄洪波1(1.沈阳师范大学生命科学学院,沈阳 110034;2.广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 广西水稻遗传育种重点实验室,南宁 530007;3.中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081;4.海南三亚中国农业科学院国家南繁研究院,三亚 571700;5.国际水稻研究所,菲律宾马尼拉 DAPO box 7777
3、)摘 要:株高是影响水稻产量稳定性的重要因素之一,水稻株高相关 QTL 的定位及候选基因的挖掘,有助于深入了解株高分子调控机制,进而为培育理想株型的水稻品种奠定基础。以油占 8 号及广西野生稻为亲本构建的 285 个 CSSL 群体为试验对象,结合 NGS 与 BSA-seq 等方法,利用 SNP 和 InDel 两种分子标记进行关联分析,对可能与株高相关的基因组区段进行定位。结果显示,(SNP-index)分子标记在 Chr.7 和 Chr.10 中分别关联到 3.205 和 1.311 Mb 大小的候选基因组区域。(InDel-index)标记关联到的基因组区域大小分别为 2.848 和
4、1.292 Mb,且全部包含于(SNP-index)关联到的区间内。结合 GO、KEGG、Uniprot、eggNOG等数据库中的功能注释、高质量多态性位点筛选以及已有的株高相关转录组数据,最终关联到 Chr.7 中的 5 个候选基因,包括功能和机理已知的 OsTCP21。RT-qPCR 结果显示,OsTCP21 在高株和矮株中的表达差异与已有研究结果相一致,LOC_Os07g05050 和LOC_Os07g02850 在高株中表达量较高,LOC_Os07g04220 和 LOC_Os07g02770 在矮株中表达量较高。这 5 个候选基因在水稻株高性状的调控中起重要的作用,OsTCP21 是
5、一个关键调控基因。关键词:水稻;株高;定位;BSA-seq;RNA-seqDOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0386Identification of Rice Plant Height-associated QTL Using BSA-seq and RNA-seqWU Yuan-ming1 LIN Jia-yi1 LIU Yu-xi1 LI Dan-ting2 ZHANG Zong-qiong2 ZHENG Xiao-ming3,4,5 PANG Hong-bo1(1.College of Life Science,Shenyang Normal
6、 University,Shenyang 110034;2.Rice Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;3.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081;4.Sanya National Research Institute of Breeding in Hainan,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Sanya
7、571700;5.International Rice Research Institute,Metro Manila DAPO box 7777,Philippines)Abstract:The stability of rice yield is significantly influenced by plant height,making it as a crucial factor.The identification of plant height-associated QTLs and mining of candidate genes are conducive to compr
8、ehending the molecular regulatory mechanisms that determines plant height,which may lay a foundation for breeding ideal rice varieties.This study employed 285 CSSL populations derived from the parental strains of Oryza sativa var.Youzhan 8 and wild rice from Guangxi as the experimental cohort.The st
9、udy utilized SNP and InDel molecular markers,in conjunction with NGS and BSA-seq techniques,to conduct an association analysis aimed at identifying genomic regions that are potentially associated with plant height.As results,the molecular markers(SNP-index)were discovered to have an association with
10、 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8174株高是影响水稻(Oryza sativa L.)产量的重要农艺性状之一,自“绿色革命”的兴起1-2以及与株高相关代表基因 sd13和 Rht4被发现并阐明作用机制后,形成了对株高与产量之间关系的正确理解:适度的植株矮化增强了其抗倒伏性,使产量更加稳定。普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)是亚洲栽培稻的祖先,广泛分布于全球各地,遗传多样性丰富,具有较强的适应性和抗逆能力,是栽培稻品种改良和培育的重要种质资源库。染色体片段代换系(chromosome segment substi
11、tution lines,CSSLs)群体作为分子育种研究中常用的试验材料之一,其主要特点是来源于亲本的单个染色体段被替换成轮回亲本背景,即每一个 CSSL 除了携带 1 个或少数几个来自供体亲本的代换片段外,其遗传背景均和轮回亲本一致,能有效简化遗传背景,是研究 QTL 的重要群体之一。随着现代生物技术的发展,越来越多与株高性状相关的基因与数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)被成功定位。如 Liu 等5在水稻第 5 染色体定位的抗倒伏基因 SBI,该基因编码 GA-2 氧化酶,通过抑制赤霉素(gibberellins,GAs)的活性控制水稻株高,遗传分析
12、表明,SBI 是控制水稻抗倒伏能力的半显性基因,其等位基因表现出一系列不同的产物活性。Tu 等6通过构建 RILs(recombinant inbred lines)在一个主效 QTL-qPND1 内定位到编码细胞分裂素(cytokinin,CTK)氧化酶的候选基因OsCKX2/Gn1a,该基因第 3 外显子中 11 bp 的缺失使得带有不同亲本型等位基因个体的抗倒伏能力表现出极显著的差异,后续研究发现抗倒伏型 gn1a 与SCM27之间的相互作用可进一步增强水稻的抗倒伏能力。最新发现的 OsFBK48和 DHT19,前者编码具有 F-box 和 kelch repeat 结构的蛋白,通过抑制
13、 GAs 活性进而促进矮化,后者的产物参与构成剪接体使独脚金内酯(strigolactone,SL)受体基因 D14正常表达,D14 促进 SL 信号抑制物 D53 的降解,令SL 正常发挥作用,进而抑制分蘖形成,其突变形式dht1 使 D14 的 mRNA 剪接受阻,SL 无法发挥作用,进而促进分蘖形成以促进矮化。这一系列研究发现株高的本质是受一系列基因与环境因素共同制约的数量性状10-11。GA12和油菜素内酯(brassinolide,BR)13是已知的参与株高调控过程的关键成员,后续发现 SL14和生长素(auxin,IAA)15也参与这一过程。虽然已经在水稻中鉴定到一些与株高相关的Q
14、TL 和相关基因,但相比于株高这个复杂的数量性状而言,对于这些基因的功能和调控机制的理解还不充分。需要进行更多的研究来挖掘株高基因,以充分理解它们在株高调控中的作用。本研究使用籼稻油占 8 号和广西普通野生稻构建的 CSSL 群体以及现代分子生物学技术,对广西普通野生稻进行研究,通过二代测序(next generation sequencing,NGS)和混池分析(bulk segregation analysis,BSA)方法,鉴定广西普通野生稻基因组中与株高相关的 QTL,进而筛选出在株高调控中可能起到关键作用的候选基因。同时,运用 RNA-seq 分析进一步验证这些候选基因在株高调控过程
15、中的表达量与水平,为进一步探究水稻株高调控机制提供了重要的理论指导和研究思路,为培育理想株型的水稻提供理论依据。candidate genomic regions of 3.205 and 1.311 Mb in Chr.7 and Chr.10,respectively.The genomic regions linked with(InDel-index)markers were of sizes 2.848 and 1.292 Mb,and were entirely encompassed within the intervals associated with(SNP-index).
16、Through the integration of functional annotation in GO,KEGG,Uniprot,and eggNOG databases,as well as high-quality polymorphic site screening and existing transcriptome data pertaining to plant height,five candidate genes located in Chr.7 were ultimately linked to this trait,including the previously c
17、haracterized OsTCP21 function and mechanism.The qRT-PCR findings were consistent with prior research,revealing differential expression of OsTCP21 in tall and dwarf plants.Specifically,LOC_Os07g05050 and LOC_Os07g02850 demonstrated elevated expressions in tall plants,whereas LOC_Os07g04220 and LOC_Os
18、07g02770 had higher expressions in dwarf plants.The regulation of rice plant height is significantly influenced by five candidate genes,with OsTCP21 being identified as a pivotal regulatory gene.Key words:rice;plant height;mapping;BSA-seq;RNA-seq2023,39(8)175吴元明等:基于 BSA-seq 和 RNA-seq 挖掘水稻株高相关 QTL 1
19、材料与方法 1.1 材料以 广 西 普 通 野 生 稻(Oryza rufipogon Griff.)(Guangxi common wild Rice,GCWR)和籼稻油占 8 号(Oryza sativa L.)(Youzhan8,YZ8)分别作为供体和受体,按照图 1 所示流程,采用单粒传法构建得到285 个 CSSL 群体,由广西壮族自治区农业科学院水稻研究所提供。2012?2012,winter,Guangxi2013?2013,summer,Guangxi2013?2013,winter,Guangxi2014?2014,summer,Guangxi2014?2014,winter
20、,Guangxi2015?2015,summer,Guangxi2018?2018,summer,GuangxiGCWR?YZ8?F1?YZ8BC1F1YZ8YZ8YZ8BC2F1BC3F1BC4F1BC4F7?GCWR:广西野生稻;YZ8:油占 8 号GCWR:Guangxi Common Wild Rice;YZ8:Youzhan8图 1 本研究所用的回交群体的构建过程Fig.1 Construction process of the backcross populations used in this study1.2 方法1.2.1 株高表型鉴定与极端性状混池的构建 每个CSSL 群体
21、随机选取 20 粒种子种植于海南省三亚市国家南繁研究院的试验田中,亲本与子代各群体均随机选取 5 株用于测量抽穗期株高。分别选取最高株和最矮株的 20 个系构建高株池(H-pool)和矮株池(L-pool),收集其叶鞘和节间组织,液氮快速冷冻后,提取其基因组 DNA 和总 RNA。1.2.2 总 DNA 的提取及 NGS 测序 采用 CTAB 法从每个极端群体提取总量为 1.5 g 的基因组 DNA作为构建文库的原料,按照生产商提供的标准使用Truseq Nano DNA HT Sample preparation Kit(Illumina USA)构建测序文库。大致流程为:总 DNA 由超声
22、波处理形成长度为 350 bp 的片段,对其进行末端修复、3 末端添加 A 尾、连接接头等处理用于后续的Illumina 测序和 PCR 扩增。PCR 产物在 AMPure XP system 中进行纯化,文库经 Agilent2100 Bioanalyzer和 real-time PCR 完成定量分析。经上述方法构建完成的文库在Illumina HiSeq 4000 platform中完成测序,最终生成全长为 350 bp 的双端测序片段。1.2.3 测序数据质控及比对 原始测序数据需要经过一系列质量控制程序的处理,去除人为误差后可用于参考基因组比对和后续分析。质量控制标准包含以下 3 个方
23、面:(1)去除未知碱基含量 10%的片段;(2)去除碱基质量值 10 nt 的片段,该过程允许的最高错误匹配几率为 10%。将上述质控处理后的样品测序数据用 Burrows-Wheeler Aligner(BWA)16软件对比至 Nipponbare(NIP)基因组中(settings:mem-t 4-k 32-M-R),参考基因组 MSU 7.0 下载自 http:/rice.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/all.dir
24、/。SAMtools software17用于将比对结果转化为 bam 文件(settings:-bS-t)。1.2.4 基于 NGS 测序的 BSA-seq 分析与候选基因挖掘 GATK18软件中的 Unified Genotyper function用于完成对各样品 SNP 和 InDel 的检测,并分别使用 GATK 中 不 同 的 参 数 对 SNP(settings:-cluster-WindowSize 4,-filter Expression“QD60.0|M-Q40.0”,-G_filter“GQ20”)和 InDel(set-tings:-filter Expression“
25、QD200.0|Read PosRankSum-20.0|Inbreeding Coeff-0.8”)进行过滤以防止低质量和无效的分子标记对后续分析造成影响。用 ANNOVA19将过滤后的 SNP 和 InDel 在参考基因组文件中进行注释。以日本晴基因组 MSU 7.0 作为参考,比对子代池中与参考基因组在特定碱基位点相同或不同的reads 数量,计算不相同 reads 数量占总数的比例,即 为 SNP-index。InDel-index 的 计 算 方 法 与 SNP-index 基本相同,只是 InDel 涉及长度不等的 DNA 片段而非单个碱基。若两个子代池中出现 SNP/InDel-
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