干旱胁迫下油用牡丹‘凤丹’基因组DNA甲基化分析.pdf
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1、收稿日期:2022-03-10基金项目:河南省中原学者项目(212101510003);河南省自然科学基金项目(202300410119);河南省高校科技创新人才支持计划(22HASTIT036)作者简介:樊明月(1995),女,硕士,主要从事牡丹分子生物学研究。E-mail: 通信作者,E-mail:上海农业学报 2023,39(4):10-16http:Acta Agriculturae ShanghaiDOI:10.15955j.issn1000-3924.2023.04.02樊明月,李昱莹,王璨,等.干旱胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析J.上海农业学报,2023,39(4)
2、:10-16.干旱胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析樊明月,李昱莹,王 璨,侯小改,郭丽丽(河南科技大学农学院,洛阳 471023)摘 要:利用甲基化敏感扩增多态性技术探究不同干旱处理下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化的水平及其变异模式。结果表明:凤丹4 年生植株的基因组 DNA 甲基化率为 93.24%;随着干旱程度的加强,凤丹基因组 DNA 发生甲基化变化位点的比率呈先上升后下降的趋势;对不同程度干旱处理后的凤丹进行复水,与对照植株相比,复水后的凤丹植株基因组 DNA 总甲基化率均表现为上升。干旱胁迫下凤丹基因组 DNA 甲基化出现 4 种变异模式,表现为 15 种条带类型。轻
3、度干旱诱导凤丹基因组 39.78%的位点发生了甲基化,40.00%的位点发生了去甲基化;重度干旱诱导凤丹基因组 46.00%的位点发生了甲基化,38.60%的位点发生了去甲基化,表明干旱胁迫会诱导凤丹基因组 DNA 甲基化状态发生改变。关键词:油用牡丹凤丹;干旱胁迫;DNA 甲基化;甲基化敏感扩增多态性中图分类号:S685.11 文献标志码:A 文章编号:1000-3924(2023)04-010-07Analysis of genomic DNA methylation of oil tree peony(Paeonia ostii)Fengdanunder drought stressFA
4、N Mingyue,LI Yuying,WANG Can,HOU Xiaogai,GUO Lili(College of Agriculture,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)Abstract:The methylation sensitive amplification polymorphism(MSAP)technique was used to explore thegenome DNA methylation levels and variation patterns of oil tre
5、e peony(Paeonia ostii)Fengdan underdifferent drought treatments.The results showed that the genome DNA methylation rate of P.ostii Fengdan4-year-old plants was 93.24%.With the intensification of drought,the proportion of loci where genomic DNAmethylation changed showed a trend of first increasing an
6、d then decreasing.After rehydrating the P.ostiiFengdan plants treated with different degrees of drought,compared with the control,the total methylation rateof genomic DNA in P.ostii Fengdan plants increased after rehydration.Under drought stress,there were4 variation patterns of DNA methylation in t
7、he genome of P.ostii Fengdan,which were represented by 15 bandtypes.Slight drought induced methylation at 39.78%and demethylation at 40.00%of the loci in the genome ofP.ostii Fengdan;Severe drought induced methylation at 46.00%and demethylation at 38.60%of the loci inthe genome of P.ostii Fengdan,in
8、dicating that drought stress could induce changes in the methylation status ofP.ostii Fengdan genomic DNA.Key words:Paeonia ostii Fengdan;Drought stress;DNA methylation;Methylation sensitive amplificationpolymorphism全球变暖所导致的干旱等气候问题对植物造成了严重影响1,降水量不足以及降水模式改变使干旱成为非生物胁迫中最具破坏性及最能影响作物产量的重要因素2-5,极大限制了植物的正常
9、生长发育6-8。干旱对植物的影响贯穿植物生长发育的各个阶段,不仅影响植物的生长形态,还可引起植物体内生理生化发生变化9-11。已有研究证明,干旱胁迫可诱导植物基因组 DNA 甲基化状态发生改变12-13。上 海 农 业 学 报DNA 甲基化是植物自身应对干旱胁迫重要的途径之一,可通过改变植物基因表达水平,引起不同生理反应,从而适应干旱14-15。DNA 甲基化作为表观遗传学的重要研究内容,其在调控基因表达、维持基因组稳定性等方面具有重要作用16-17。随着对 DNA 甲基化的研究日益精进和分子研究技术手段的不断发展,DNA 甲基化检测的方法和手段日新月异。其中,甲基化敏感扩增多态性(Methy
10、lation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术是利用限制性内切酶 HpaII 和 MspI 对基因组 DNA 进行特异性酶切,酶切后获得不同的 DNA切割片段,以此来揭示植物基因组 DNA 的甲基化状态18。该方法中的限制性内切酶 HpaII 和 MspI 可识别相同的 5-CCGG 序列19,基于其对胞嘧啶的敏感程度不同,HpaII 选择性酶切一条链被甲基化的位点,而 MspI 选择性酶切双链内侧被甲基化的位点,HpaII 和 MspI 均可切割无甲基化位点20-21。牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)作为
11、中国传统名花,在我国有着悠久的人工栽培应用历史22,其观赏价值和药用价值被广泛肯定23。油用牡丹凤丹(P.ostii Fengdan)作为新兴的油用作物,籽油品质高,且其生态适应性强24-25,于 2011 年被国家卫生部批准为新资源食品26-28。随着国家对新型油料作物的大力扶持和油用牡丹产业链的不断完善,人们对油用牡丹的关注度越来越高,不断深入研究挖掘其潜在价值。本试验研究不同干旱处理下凤丹基因组 DNA 的甲基化差异及其变异模式,分析干旱胁迫对凤丹基因组 DNA 甲基化带来的影响,以期为其在培植繁育等方面的研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料试验材料为河南省洛阳市国际牡丹园内
12、 4 年生油用牡丹凤丹。挑选长势良好且生长情况一致的 4年生凤丹,移栽于规格为 20 cm 16 cm 13 cm 的花盆中,所有植株的光照条件一致。1.2 试验方法1.2.1 试验设计试验设对照组(按 80%的日蒸腾量 57.4 mL 浇水)、轻度干旱处理组(按 40%的日蒸腾量 28.7 mL 浇水)及轻度干旱复水处理组、重度干旱处理组(干旱过程中不浇水)及重度干旱复水处理组。不同处理组植株均在干旱处理 14 d 后出现表型;对出现表型的轻度干旱复水处理组和重度干旱复水处理组植株进行复水处理,对其正常浇水即为复水,复水处理 3 d 后,轻度干旱处理组植株恢复至正常状态的表型,复水处理 5
13、d 后,重度干旱处理组植株恢复至正常状态的表型。随机选取同一处理组不同植株上的完整叶片,混合放在锡箔纸上,包裹、标记,放入液氮中低温冷冻保存、待用。1.2.2 甲基化敏感多态性分析(1)采用改良的 CTAB 法提取处理后的凤丹叶片基因组 DNA29。(2)采用付胜杰等30建立的 MSAP 反应体系及程序对凤丹基因组 DNA 进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增。选择 EcoRIMspI 和 EcoRIHpaII 作为双酶切组合,对凤丹基因组 DNA 进行双酶切,MSAP分析所用接头和预扩增引物序列见表 1。表 1 MSAP 分析的接头序列和引物序列Table 1 Adapter sequence
14、s and primer sequences for MSAP analysis引物和接头接头预扩增引物E c o R I?a d a p t e r IE c o R I?a d a p t e r I IH p a I I?Ms p I?a d a p t e r IH p a I I?Ms p I?a d a p t e r I IE?0 0H p a I I/Ms p I?0 0核苷酸序列(5?3 )C T C G T A G A C T G C G T A C CA A T T G G T A C G C A G T C T AG A C G A T G A G T C C T G
15、A GT A C T C A G G A C T C A TG A C T G C G T A C C A A T T CG A T G A G T C C T G A G C G G (3)为方便酶切体系的配制,需将 DNA 样品质量浓度保持一致(400 ngL),酶切体系共20 L,包含1 L 基因组 DNA、1 L EcoRI、1 L HpaIIMspI、2 L 10 EcoRI Buffer、2 L HpaIIMspI Buffer,用无菌双蒸水补齐。(4)酶切后应立即进行连接反应,连接反应体系共 20 L,包含 2 L 10 T4 连接酶 Buffer、1 L T411樊明月等:干旱
16、胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析连接酶、0.4 L HpaII-MspI 接头、0.4 L EcoRI 接头、10 L 酶切产物,用无菌双蒸水补齐,连接产物需16 过夜;过夜连接后的产物于 65 温育 10 min 后终止反应。(5)以连接产物作为模板进行预扩增,预扩增反应体系共 20 L,包含 10 L 连接产物、预扩增引物各 0.5 L、0.2 L Taq DNA 聚合酶、0.4 L dNTPs、2 L PCR Buffer,用无菌双蒸水补齐。(6)预扩增完成后,用稀释 40 倍的预扩增产物作为模板进行选择性扩增,MSAP 选择性扩增反应体系共 20 L,包含 2 L 预扩增产
17、物、特异性扩增引物各 1 L、10 L Taq DNAMix,用无菌双蒸水补齐。(7)配制浓度为 6%(体积比)的变性聚丙烯酰胺凝胶,将选择性扩增获得的 PCR 产物上样于聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直电泳,电压 220 V,电泳时间 140 min。电泳结束后对凝胶进行银染,观察条带。1.2.3 数据分析染色显影后,观察统计每个 PAGE 胶图版的条带,在同一位点处有清晰条带显示记为“1”,无条带显示处记为“0”。通过 Quantity One 软件读取 MSAP 条带信息并转化成表型数据 01 矩阵,统计结果制成Excel 表格。2 结果与分析2.1 干旱胁迫对凤丹牡丹表型变化的影响在干旱胁迫下
18、,凤丹植株的叶片形态变化显著,叶片长势明显变差,具体表现为:轻度干旱时,植株叶片开始下垂,并出现萎蔫和发黄;重度干旱时,叶片出现严重的干枯卷曲,叶片数量减少,枝条下垂。对不同程度干旱处理后的植株进行复水处理,轻度干旱复水的植株仍能恢复其生命活力,外观上基本恢复正常,叶片皱缩和萎蔫消失,叶片舒展,但与对照植株相比,仍表现出叶片发黄、叶片数量减少的现象;重度干旱的植株复水后也仍具有生命力,但与对照植株相比,叶片发黄且较为皱缩,枝条下垂(图 1)。对照轻度干旱重度干旱轻度干旱复水重度干旱复水图 1 干旱胁迫对凤丹表型变化的影响Fig.1 Effects of drought stress on ph
19、enotypic changes of P.ostii Fengdan2.2 不同干旱胁迫下凤丹牡丹总甲基化状态使用 EcoRIMspI 和 EcoRIHpaII 组合对样品 DNA 酶切后,检测出 4 种甲基化类型(图 2),分别为 I 型(超甲基化):H、M 均无带,DNA 双链外部甲基化或双链内外部都甲基化,记为(0,0);II 型(全甲基化):H无带、M 有带,DNA 双链内部甲基化,记为(0,1);III 型(半甲基化):H 有带、M 无带,DNA 单链外部甲基化,记为(1,0);IV 型(非甲基化):H、M 均有带,即 DNA 双链的 CCGG 位点无甲基化发生,记为(1,1)。I
20、)超甲基化:H、M 均无带;II)全甲基化:H 无带、M 有带;III)半甲基化:H 有带、M 无带;IV)非甲基化:H、M 均有带。图 2 选择性扩增凝胶电泳图谱Fig.2 Selectively amplification gel electrophoresis21上 海 农 业 学 报以 30 对选择性引物进行扩增,通过观察比对筛选出多态性丰富、重复性较好的 26 对引物组合,使用MSAP 检测分析不同处理下凤丹牡丹基因组 DNA 甲基化状态(表 2)。结果显示,26 对选择性引物共扩增出932 个 CCGG 位点。对照植株半甲基化位点(III 型)有115 个,半甲基化率为12.34%
21、;全甲基化位点(II 型)86 个,全甲基化率为 80.90%。在不同程度干旱处理组中,轻度干旱和重度干旱的凤丹牡丹半甲基化位点分别为103 个和101 个,半甲基化率分别为11.05%和10.84%;全甲基化位点分别为140 个和174 个,全甲基化率均为85.09%。轻度干旱诱导凤丹牡丹基因组 DNA 的半甲基化率下降了1.2%;重度干旱诱导其半甲基化率下降了 1.5%;轻度干旱和重度干旱胁迫下,凤丹牡丹的全甲基化率均表现为上升趋势,升幅为 4.2%。干旱复水处理组的凤丹牡丹基因组 DNA 半甲基化位点数和全甲基化位点数均发生改变。统计结果显示:轻度干旱复水后,凤丹牡丹的半甲基化位点有 1
22、19 个,半甲基化率为 12.8%,全甲基化位点有161 个,全甲基化率为83.4%,与对照相比,半甲基化率和全甲基化率均呈现上升趋势;与轻度干旱处理组相比,半甲基化率升高了 1.7%,全甲基化率降低了 1.7%。重度干旱复水后,凤丹牡丹的半甲基化位点有 68 个,半甲基化率为 9.7%,全甲基化位点有 174 个,全甲基化率为 85.0%,与对照相比,半甲基化率降低了 2.6%,全甲基化率升高了 4.1%;与重度干旱处理组相比,半甲基化率降低了 1.1%,全甲基化率降低了 0.1%。表 2 不同干旱条件下凤丹基因组 DNA 甲基化水平Table 2 Genomic DNA methylati
23、on levels of P.ostii Fengdanunder different drought stress处理对照轻度干旱轻度干旱复水重度干旱重度干旱复水条带类型数量(I、I I、I I I、I V)6 6 8、8 6、1 1 5、6 36 5 3、1 4 0、1 0 3、3 66 1 6、1 6 1、1 1 9、3 66 1 9、1 7 4、1 0 1、3 86 5 3、1 7 4、6 8、3 6总甲基化位点(I I I I I I)8 6 98 9 68 9 68 9 48 9 5全甲基化位点(I I I)7 5 47 9 37 7 77 9 38 2 7总甲基化率/%9 3.2
24、 49 6.1 49 6.1 49 5.9 39 6.0 3全甲基化率/%8 0.9 08 5.0 98 3.3 78 5.0 98 8.7 3半甲基化率/%1 2.3 41 1.0 51 2.7 71 0.8 47.3 0 注:总甲基化率=(I+II+III)(I+II+III+IV)100%;全甲基化率=(I+II)(I+II+III+IV)100%;半甲基化率=III(I+II+III+IV)100%。2.3 干旱诱导的凤丹牡丹甲基化变化和去甲基化变化分析不同程度干旱处理后下凤丹牡丹基因组 DNA 甲基化的变异模式,发现 26 对选择性引物在不同处理的样本中扩增产生了 4 种变异模式,共
25、 15 种条带类型(表 3 和表 4)。表 3 轻度干旱处理下凤丹基因组 DNA 甲基化模式的变化Table 3 Changes in genomic DNA methylation patterns of P.ostii Fengdan under slight drought treatment模式无变化去甲基化甲基化特殊模式类型A 1A 2A 3B 1B 2B 3B 4B 5C 1C 2C 3C 4C 5D 1D 2带型对照H p a I I110100001111010Ms p I101010001110101轻度干旱H p a I I110111101000001Ms p I1011
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