光动力疗法基础研究进展——浅谈ALA-PDT增效策略.pdf
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1、http:/专家笔谈Apr.2023.Vol.40.No.2Dermatology Bulletin2023年4月皮肤科学通报2023年4月第40 卷第2 期光动力疗法基础研究进展浅谈ALA-PDT增效策略邱海霞,郭星冉,朱杏帽,胡永基4,王昕?,黄正摘要5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinicacid,A L A)是血红素生物合成的前体,在线粒体中形成原啉IX(protoporphyrin IX,PpIX),Pp IX 的特征性荧光可用于辅助手术和光动力诊断,PpIX介导形成的单态氧所导致的光敏作用可用于光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)。本综述结合基础研究
2、进展,对具有临床应用可行性的ALA-PDT增效策略做一系统介绍。关键词 5-氨基酮戊酸;原叶啉IX;光动力疗法;增效策略中图分类号R454.2;R 75文献标识码A文章编号2096-4382(2023)02-0149-09Basic Research Progress of Photodynamic Therapy:BriefDiscussion on Augmentation Strategy of ALA-PDTQIU Haixia,GUO Xingran,Ellie S.M.Chu,Ricky W.K.Wu,WANG Xin,HUANG Zheng?(1.The First Medica
3、l Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China;2.Key La-boratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of Minister of Education,FujianNormal University,Fuzhou 350007,China;3.School of Medical and Health Sciences,Tung WahCollege,Hongkong 999077,China;4.Department of Bio
4、logical and Biomedical Sciences,Glas-gow Caledonian University,UK)Corresponding authorHUANG Zheng,E-mail:huangz Abstract 5-aminolevulinic acid(A L A)i s t h e p r e c u r s o r o f h e me b i o s y n t h e s i s a n d f o r msprotoporphyrin IX(PpIX)in the mitochondria.The characteristic fluorescence
5、 of PpIXcan be used to assist surgery and photodynamic diagnosis.The photosensitization caused基金项目国家自然科学基金(8 147 17 0 3);中央引导地方科技发展专项(2 0 2 0 L3008)作者单位1.解放军总医院第一医学中心,北京10 0 8 53;2.福建师范大学光电与信息工程学院,医学光电科学与技术教育部重点实验室,福建福州350 0 0 7;3.东华学院医疗及健康科学学院,香港9990 7 7;4.格拉斯哥卡利多尼安大学,生物和生物医学科学系,英国格拉斯哥G40BA通信作者黄正,E
6、-mail:huangz http:/?150皮肤科学通报2 0 2 3年4月第40 卷第2 期by PpIX-mediated singlet oxygen can be used for photodynamic therapy(PDT).Based on the progress of basic research,this article will provide a systematicintroduction on the clinically feasible augmentation strategies for ALA-PDT.Key wordsALA;PpIX;Photod
7、ynamic therapy;Augmentation5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid),也称S-氨基酮戊酸(-aminolevulinic acid)或-氨基-酮戊酸(后简称“ALA”),是叶啉(porphyrin)和血红素(h e m e)生物合成的起始物。ALA在线粒体内可转化为原叶啉IX(p r o t o p o r p h y r i n IX,Pp IX),Pp IX 是ALA介导的光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)中的关键光敏物质。自1990 年加拿大学者首次报道利用ALA介导PpIX的光敏化作用成功治疗皮肤肿瘤,联合使用AL
8、A和照光的体表光动力疗法逐渐成为皮肤科的一个常规治疗技术12 。ALA/PpIX介导的光动力疗法和光动力诊断已成为光动力医学的重要分支,相关的基础研究也一直备受重视,基础研究与临床前研究与临床转化的密切衔接有助于推动光动力诊疗的临床应用3。本文以国内外基础研究的发现和共识为基础,结合具有临床应用可行性的增效策略,对ALA-PDT基础研究的一些进展做简要综述。15-氨基酮戌酸简介5-氨基酮戊酸分子式为C,HNO3,分子量为131.13。A L A 是一种重要的有机合成中间体,也是生物体的内源性物质,是血红素和叶绿素生物合成的前体(precursor)。非光合作用的真核生物的ALA合成是在线粒体中
9、,通过Shemin途径,在ALA合成酶的作用下由甘氨酸和琥珀酰辅酶A为起始物合成的。在植物、藻类和细菌(如痤疮丙酸杆菌)中,ALA的合成主要是以谷氨酸为起始物,通过C5或Beale 途径合成的4 光动力疗法中使用的是ALA的盐酸盐,化学名称为5-氨基4-氧戊酸盐酸盐,其分子式为CsHloCINO3,分子量为16 7.59,是白色至灰白色结晶固体,可溶于水,但在水溶液中不稳定。ALA盐酸盐(A L A H CI)也常被简称为ALA。虽然ALA或ALAHCl也被称为“第二代”光敏剂(photosensitizer),但ALAHCI本身不具有光敏性,是ALA-PDT使用的前体药(pre-drug或p
10、ro-drug)。目前,除了使用ALAHCI,光动力疗法和光动力诊断还可使用其酯类衍生物,如甲基ALA(或称ALA甲酯)和已基ALA(或称ALA己酯)52原叶味IX简介原叶啉IX(Pp IX)是一种有机化合物,分子式为CH34H34N.04,分子量为56 2.6 58。是自然界最常见的叶啉物质,也是血红素、细胞色素c和叶绿素等生物必需辅基的重要前体,是由四个吡咯类亚基形成的杂环分子,能够有效吸收光子。在自然界中,游离PpIX分子以铁复合物的形式存在,在细胞内与亚铁(Fe+)螯合时形成亚铁原啉或血红素原啉IX是一种光敏性较强的荧光色团(flu-orophore),但因其水溶性差,直接使用时组织和
11、细胞无法吸收,因此不能直接作为光敏剂药物使用。但PpIX具有理想光敏剂的其他基本性质,如血啉衍生物(hematoporphyrinderivative,H p D)类光敏剂的典型光学特性。具体表现为:PpIX分子在Q带有若干吸收峰(如6 33nm),使用红蓝光波长的激光或LED,甚至日光作为光源照射,PpIX分子受光照激发,通过与周围分子氧(molecular oxygen)之间的能量转换,可诱发产生单态氧(singletoxygen,O,),亦称单线态氧或单重态氧。因此,本质上讲,ALA-PDT中的光化学、光物理和光生物作用机制是通过PpIX和分子氧介导的6 ;PpIX分子在Soret带有很
12、强的吸收峰,使用该波长段的蓝紫光,如40 0 nm附近的光激发可产生较强的荧光(fluorescence),荧光发射光谱在6 0 0 7 50 nm之间呈连续光谱,与Q带的吸收谱有一定的镜像关系,形成特征性的红色荧光,可作为光动力诊断的可视化工具和PpIX定量的一个指标7 。虽然目前依旧沿用“光动力诊断”一词,但ALA/PpIX或其它光敏剂介导的荧光可视化过程并不像PDT产生单态氧过程那样需要氧分子的介人。从动物血制品中提取物制备的和半合成的HpD类光敏剂药物具有与PpIX相似的理化和光学性质,有些HpD类光敏剂药物,如Photofrin可用生理盐水和注射用水溶解后静脉注射。但体外合成的PpI
13、X的溶解性和吸收性较差,没有被制备成光敏剂药物使用。http:/TX.151皮肤科学通报2 0 2 3年4月第40 卷第2 期3单态氧简介单态氧的产生和作用是PDT的核心。特定波长的光辐射照射时,PpIX吸收光子能量后从基态(S。)进入单线态的激发态(S.),一部分PpIX以产生荧光方式回到基态,一部分会通过系间窜越(I SC)进人能量较低的三线态(T),其中一部分三线态PpIX以产生磷光方式回到基态,而另一部分的激发电子的能量与三线态氧(0,)和 O2的能级差(1.6 3e V)相近,该能量通过ISC转移到周边的三线态氧后形成单态氧(图1)8 。这个光物理和光化学反应过程称为二型(Type)
14、反应。二型光动力反应是个需氧和耗氧的过程。细胞光毒作用SISC激发态单线态T照光O,(a,A.)激发态三线态hVhVr荧光hVp1270nm磷光ISChVpMM光敏剂0,(X,2,-)So基态单线态可视化图1光敏剂受激产生单态氧过程氧分子是一种十分活泼的分子,大部分元素都能与氧分子发生反应。生物细胞组织中的氧分子是以最稳定的三线态氧即分子氧(0,)形式存在。PpIX是一种激发态寿命较长、单态氧量子产额较高的光敏物质,受光照激发后可有效地利用分子氧产生单态氧。单态氧的反应能力比 O,强几个数量级,其氧化电位为2.42 V,氧化性比常见的氧化物如过氧化氢(H,O,)的氧化性高出很多数量级,是ALA
15、-PDT氧化损伤机制中最重要的活性氧或氧活性物质(r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,R O S),单态氧引起的损伤也被称为“二型损伤”。单态氧的寿命为10 -10 秒。单态氧可通过发射一个12 7 0 nm光子回到基态,可利用单态氧的这个发光特性进行单态氧剂量学研究6 4ALA与PpIX的合成代谢ALA与PpIX的合成代谢是人体血红素合成的重要环节。骨髓和肝脏中血红素合成前体ALA的生物合成是甘氨酸和琥珀酰辅酶A在ALA合成酶(A L A S)的作用下,在线粒体中合成的;ALA扩散至胞液中,在ALA脱水酶(ALAD)作用下两分子ALA脱去两分子
16、水,缩合形成卧胆原-胆色素原类的单吡咯;在羟甲基胆素合成酶(HMBS,也称胆色素原脱氨酶,BCD)作用下四分子胆原脱氨缩合形成羟甲基胆素-卧啉原类线状四吡咯;再在尿叶啉原合成酶(UROS,也称尿卧啉原同合酶,UCS)作用下形成尿吓啉原-四吡咯环结构;在尿叶啉原脱羧酶(U R O D 或UDC)的作用下形成粪叶啉原;扩散至线粒体中的粪叶啉原在粪吓啉原氧化酶(CPOX或CPO)的作用下形成啉物质原叶啉原IX,在原啉原IX氧化酶(PROX或PRO)作用下脱去6 个氢原子形成原叶啉IX-大共轭体系;后者在亚铁螯合酶(FECH或FC)的作用下与亚铁离子螯合生成亚铁原叶啉IX或血红素;血红素离开线粒体后继
17、续参与血红蛋白合成(图2)4。血红素使血液在光线照射下呈现红色,血红素是血红蛋白的关键组分。正常情况下,ALA与血红素的合成代谢是受到严格控制的。ALA合成酶是限速酶,机体通过细胞内血红素的含量反馈抑制ALA合成酶,通过抑制ALA合成酶的合成,控制ALA的合成和浓度,所以体内不会产生ALA的过量蓄积,并维持稳定的血红素和PpIX及其叶啉前体的水平。人体正常情况下,在正常的日光或照明灯光照射情况下,皮肤组织中的这些具有光敏性的血红素前体的含量不足以引起光敏反应和对健康不利的影响。http:/.152皮肤科学通报2 0 2 3年4月第40 卷第2 期照光甘氨酸外源性ALA+琥珀酰辅酶AFECHIA
18、LAS血红素原吓啉区Fe3ALAPROX原卧啉原X线粒体CPOX胞液外源性ALAALADHMBSUROD2ALA4叶胆原尿外啉原粪吓啉原UROS图2血红素生物合成过程如果血红素合成代谢环节中某个酶或酶活性缺乏,如遗传疾病导致的相应酶的基因异常或突变,则可导致叶啉病(porphyria),血红素生物合成通路中的8 个酶分别对应8 种吓啉病,可引起急性啉病、皮肤吓啉病和肝叶啉病等9。临床表现取决于特定的吓啉前体在某个组织中的异常积聚和相应的症状。吓啉病患者的过量叶啉前体可能在血液中过量存在,或者通过尿液或粪便排泄。皮肤吓啉病患者的皮肤组织中具有光敏性的叶啉类血红素前体异常积聚,在正常的日光或照明灯
19、光照射情况下,可能都会引起皮肤损伤。光动力疗法中系统用药和局部用药所导致的皮肤光敏化(cutaneousphotosensitiza-tion)与皮肤叭啉病的皮肤损伤机制有一定相似性。ALA/PpIX介导的光动力治疗过程的一个重要机制是通过使用过量的ALA,绕过ALA与PpIX的合成代谢中的负反馈抑制。在皮肤黏膜局部或系统使用了ALA药物后,过量外源性ALA进入细胞后,反馈抑制ALA和PpIX及其中间化合物代谢合成的正常机制被干扰,从而导致短时间内过量产生和暂时性的内源性吓啉物质积聚,特别是光敏性很强的PpIX的产生和积聚,为光动力治疗提供了重要物质基础。5ALA/PpIX介导的光动力作用PD
20、T是一种药械联用的微创治疗技术,一般分为局部或系统给予光敏剂(药)和使用特定光源(械)照光两个步骤。除了光敏剂的剂量和照光的剂量,给药至照光的间隔时间也是控制光动力作用的重要参数,通常选择当光敏剂在靶细胞靶组织中浓度达到峰值期时照光6 。鉴于分子氧是单态氧形成过程中的关键因素,光敏剂、光和分子氧通常被称为光动力疗法的三要素。ALA则可视为是ALA-PDT三要素中的一个要素。ALA可局部使用或口服。小鼠静脉注射ALA后,在皮肤、口腔黏膜、胆管、胆囊、尿道上皮等组织可见较强的PpIX荧光。口服后,皮肤中的PpIX荧光峰值在6.5 9.8 h中间,血浆PpIX荧光峰值约在6.7 h。而体表使用ALA
21、,血浆中则不会检测到PpIX7。相较于其它光敏剂,ALA-PDT的一个优越性就是PpIX的半衰期较短,系统性或局部皮肤光毒性时间较短。ALA-PDT已用于治疗多种皮肤疾病,主要适应症包括非黑色素皮肤癌(如BCC、原位SCC)、癌前病变(如AK)、H PV感染性疾病(如尖锐湿疣)和感染性疾病(如痤疮)等10 。尽管治疗这些疾病的机理尚不完全清楚,但一个比较重要的现象是PpIX在治疗的病灶中都有较明显的选择性积聚。其中一种解释是这些病变细胞和组织中的血红素生物合成通路与正常细胞和组织有所不同,包括FECH活性降低,ALAS、H M BS和UROD活性升高7.1。在外源性(exogenous)A L
22、 A 过量的前提条件下,这些酶活性变化的综合作用最终导致短时间内内源性(endoge-nous)Pp I X 的过度产生和积聚PpIX等吓啉光敏物质在特定波长的光线照射下产生单态氧。单态氧的氧化性极强,当靶细胞和组织中的单态氧以及其它ROS的积累超过细胞和组织自身的抗氧化能力后,可引起不可逆的细胞和组织的氧化损伤(oxidativedamage),如引起线粒体、细胞膜和核酸的损伤,诱发不同程度的坏死、凋亡、自噬和副凋亡等细胞死亡通道,这些细胞光毒性(p h o t o c y t o t o x i c i t y)可直接导致癌细胞或其他增生活跃的细胞死亡,从而达到消融性和非消融性的治疗htt
23、p:/TX.153皮肤科学通报2 0 2 3年4月第40 卷第2 期目的11-2 ,PDT的疗效不仅取决于细胞光毒作用对靶细胞的直接作用,病灶局部的炎性反应和免疫反应对治疗也有重要的间接影响,甚至能够决定治疗的成败。光动力作用可直接或间接损伤微血管的内皮细胞,引发水肿、血小板凝聚、血栓素的释放、血栓形成和补体激活链级反应等效应,这些炎性反应也可引发不同程度的远期和远位疗效,这些反应的过程和作用也会因不同病灶、不同部位和不同剂量有所不同。对于实体瘤而言,尽管局部炎性反应还不具备肿瘤表面抗原特异性,但仍具有很强的选择性,对引发的局部损伤和变化,模式识别受体(patternrecognitionre
24、ceptor)具有识别能力。肿瘤和感染性疾病的长期有效控制有赖于健全的、可产生具有抗原特异性的T淋巴细胞和B淋巴细胞的适应性免疫机制。研究显示体表光动力疗法在一定条件下能诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润。PDT是诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death)的一种疗法,其杀伤作用可能还不足以有效控制和根治实体瘤,联合特异的抗肿瘤免疫措施或能达到治疗原发病灶,甚至抑制远位转移和防止复发的效果136增效策略6.1提高ALA生物利用度6.1.1皮损预处理皮肤科临床应用初期的结果显示ALA-PDT在治疗浅表基底细胞癌中能获得良好的临床效果,但对是否适用于增厚的结节病灶有一定疑
25、虑,因为ALA不能有效的透过完整致密的角质层,ALA分子在完整和增厚的皮肤组织表面的渗透性有限,可能导致深层的病灶中的ALA生物利用度和PpIX含量有限。因此,皮损的预处理和打开皮肤屏障的一些常用的理化方法会有效提高ALA的透皮吸收率、生物利用度和作用深度,如使用深度刮除术对厚的大的病灶进行减积;使用胶带剥离法、点阵激光、微晶磨皮和微针等技术去除角质层14。皮损预处理还可以提高光线的穿透率和增加氧分子的透皮吸收,对保障和提高光动力作用都有积极的增效意义。6.1.2ALA酯类衍生物在体研究显示ALA酯类衍生物在皮肤粘膜组织中的吸收速率较水溶性的ALA更高,有些ALA甲酯和ALA已酯产品陆续进人临
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