构建沉默Runx 2基因的牙龈癌细胞慢病毒载体.pdf
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1、论著构建沉默R u n x2基因的牙龈癌细胞慢病毒载体*胡金龙 秦晗 张勇 邓晴(南京医科大学连云港临床医学院口腔科,江苏 连云港 2 2 2 0 0 2)【摘要】目的 筛选沉默成骨细胞特异性转录因子2(R u n x 2)基因的慢病毒载体,转染人上颌牙龈癌颈淋巴结转移癌细胞系GNM细胞,获得沉默R u n x2基因的G NM细胞,为探究R u n x 2在G NM细胞中的转录调控奠定实验基础。方法 根据预实验结果在含H i T r a n s G P的培养液中,病毒按照感染复数(MO I)1 0转染GNM细胞,将病毒按序号分为N C组:C ON 3 1 3;K D 1组:L V-R u n
2、x 2-R NA i(8 0 9 7 8-1);K D 2组:L V-R u n x 2-R NA i(8 0 9 7 9-1);K D 3组:L V-R u n x 2-R NA i(8 0 9 8 0-1),使用荧光显微镜观察转染1 2 0 h后各组荧光标记基因的表达;实时P C R分析R u n x 2的转录产物水平,比较R u n x2基因的组间沉默效率;W e s t e r n B l o t进一步检测R u n x 2蛋白沉默效果。结果 各组细胞经慢病毒转染,1 2 0 h后观察见细胞状态良好,其中N C组荧光表达未见;K D 1组荧光表达较高;K D 2组荧光表达最高;K D
3、3组荧光表达较低。实时P C R分析显示R u n x2基因沉默效果最佳的为K D 2组,沉默效率可达6 4.4%(P0.0 5)。W e s t e r n B l o t结果显示各实验组中K D 2组GNM细胞的R u n x 2蛋白表达最低(P0.0 5)。结论 成功筛选出特异性转染GNM细胞的慢病毒载体,同时初步确定转染实验相关适宜参数。【关键词】成骨细胞特异性转录因子2;牙龈癌;慢病毒;转染【中图分类号】R 3 4 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 8 基金项目:国家自然科学基金项
4、目(8 1 5 0 0 8 9 3)通讯作者:秦晗,主任医师,E-m a i l:q i n h a n n j m u.e d u.c n引用本文:胡金龙,秦晗.构建沉默R u n x2基因的牙龈癌细胞慢病毒载体J.西部医学,2 0 2 3,3 5(9):1 2 8 7-1 2 9 1.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 8C o n s t r u c t i o n o f l e n t i v i r a l v e c t o r o f g i n g i v a l c a n c e r c
5、e l l s i l e n c i n g R u n x 2 g e n eH U J i n l o n g,Q I N H a n,Z H A N G Y o n g,D E N G Q i n g(D e p a r t m e n t o f S t o m a t o l o g y,L i a n y u n g a n g C l i n i c a l C o l l e g e o f N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,L i a n y u n g a n g 2 2 2 0 0 2,J i a n g s
6、 u,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s c r e e n l e n t i v i r a l v e c t o r o f r u n t-r e l a t e d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 2(R u n x 2)g e n e t o t r a n s f e c t GNM c e l l s w i t h c e r v i c a l l y m p h n o d e m e t a s t a s i s f r o m h u m a n m a
7、x i l l a r y g i n g i v a l c a r c i n o m a a n d o b t a i n t h e s i l e n c i n g o f R u n x 2 g e n e e x p r e s s i o n i n GNM c e l l,w h i c h l a i d t h e e x p e r i m e n t a l f o u n d a t i o n f o r t h e l a t e r s t u d y o n t h e t r a n s c r i p t i o n a l r e g-u l a
8、t i o n o f R u n x 2 i n G NM c e l l s.M e t h o d s B a s e d o n t h e p r e l i m i n a r y r e s u l t s,i n t h e c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g H i t r a n s g P,v i r u s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h GNM c e l l s a c c o r d i n g t o m u l t i p l i c i t y o f i n
9、 f e c t i o n(MO I)1 0 a n d v i r u s e s w e r e d i v i d e d i n t o f o u r g r o u p s a c c o r d i n g t o t h e i r s e r i a l n u m b e r:N C:C ON 3 1 3;K D 1:L V-R u n x 2-R NA i(8 0 9 7 8-1);K D 2:L V-R u n x 2-R NA i(8 0 9 7 9-1);K D 3:L V-R UN X 2-R NA i(8 0 9 8 0-1),f l u o r e s c
10、e n c e m i c r o s c o p y w a s u s e d t o o b s e r v e t h e e x p r e s s i o n o f f l u o r e s-c e n c e m a r k e r g e n e s i n e a c h g r o u p 1 2 0 h a f t e r t r a n s f e c t i o n.R e a l-t i m e P C R w a s u s e d t o a n a l y z e t h e t r a n s c r i p t i o n p r o d u c t
11、l e v e l o f R u n x 2 a n d c o m p a r e t h e s i l e n c i n g e f f i c i e n c y o f R u n x 2 g e n e b e t w e e n g r o u p s.W e s t e r n B l o t f u r t h e r d e t e c t e d t h e p r o t e i n s i l e n c i n g e f f e c t o f R u n x 2 g e n e.R e s u l t s A f t e r 1 2 0 h o u r s
12、o f l e n t i v i r u s t r a n s f e c t i o n,t h e c e l l s i n e a c h g r o u p w e r e i n g o o d c o n d i t i o n.T h e f l u o r e s c e n c e e x p r e s s i o n w a s n o t o b s e r v e d i n N C g r o u p.T h e f l u o r e s c e n c e e x p r e s s i o n w a s h i g h e r i n K D 1 g
13、r o u p.T h e f l u o r e s c e n c e e x p r e s s i o n i n K D 2 g r o u p w a s t h e h i g h e s t.T h e f l u o r e s c e n c e e x p r e s s i o n w a s l o w e r i n t h e K D 3 g r o u p.R e a l-t i m e P C R a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e b e s t s i l e n c i n g e f f e c t o
14、f R u n x 2 g e n e w a s i n t h e K D 2 g r o u p.T h e s i-l e n c i n g e f f i c i e n c y w a s u p t o 6 4.4%(P0.0 5).W e s t e r n B l o t r e s u l t s s h o w e d t h a t R u n x 2 p r o t e i n e x p r e s s i o n o f G NM c e l l s i n t h e K D 2 g r o u p w a s t h e l o w e s t a m o
15、n g a l l e x p e r i m e n t a l g r o u p s(P0.0 5).C o n c l u s i o n T h e l e n t i v i r a l v e c t o r s s p e c i f i c a l-l y t r a n s f e c t e d G NM c e l l s a r e s u c c e s s f u l l y s c r e e n e d o u t,a n d r e l e v a n t a p p r o p r i a t e p a r a m e t e r s o f t r a
16、 n s f e c t i o n e x p e r i m e n t a r e p r e l i m i n a r i l y d e t e r m i n e d.【K e y w o r d s】R u n x 2;G i n g i v a l c a n c e r;S l o w v i r u s;T r a n s f e c t i o n7821西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.9 口腔鳞状细胞癌约占全身恶性肿瘤的
17、3%1,而牙龈是口腔鳞状细胞癌的最常发生部位之一,占口腔鳞状细胞癌的1 0%2 5%2。目前,基因治疗是广为研究的癌症治疗新方向,其能够在分子水平改变细胞的基因表达,从而使细胞获得新的遗传表型,实现精准、个性化的癌症治疗3。成骨细胞特异性转录因子(R u n t-r e l a t e d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 2,R u n x 2)是转录因子R u n x家族中的一员,R u n x转录因子家族在不同的组织和细胞谱系中发挥着重要作用,其中R u n x 2是胚胎期间骨骼发育和其他器官如乳腺和前列腺形态发生 过 程 中 的 必 需 转 录
18、 因 子4。相 关 研 究 表 明R u n x 2在型糖尿病肾病、骨质疏松等疾病中起重要的调控作用5-6。R u n x 2同样参与恶性肿瘤的生物学行为,与乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等多种恶性肿瘤的进展联系紧密7-8。然而R u n x 2在牙龈癌中的作用鲜有报道,在牙龈癌中的不同时空表达水平及调控机制仍未明确。本实验利用慢病毒载体转染GNM细胞,获得稳定沉默R u n x2基因的GNM细胞,为进一步探讨其在牙龈癌中的作用及其分子机制提供实验支持。1 材料与方法1.1 实验材料 胎牛血清(澳洲A u s b i a n公司),基础培 养 基 和D P B S(美 国C o r n i n
19、 g公 司),兔 抗 人R u n x 2抗体、兔抗及鼠抗I g G抗体(美国C S T公司),鼠抗人-a c t i n抗体(美国S ANT A C RU Z公司),胰酶(美国G I B C O公司),T r i z o l(上海普飞生物技术有限公司),M-ML V(美国p r o m e g a公司),o l i g o d T(上海生工生物工程技术服务有限公司),B C A P r o t e i n A s-s a y K i t(上海碧云天生物技术有限公司),R I P A 裂解液(上海鼎国生物技术有限公司)。1.2 实验方法1.2.1 慢病毒转染目的细胞 人上颌牙龈癌颈淋巴结转移癌
20、细胞系GNM细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供)冻存管从液氮罐中取出,解冻后1 3 0 0 r p m离心3 m i n,消毒后移至生物安全柜。取出冻存管吸除冻存液上清,加入1 m L完全培养基进行重悬细胞,细胞悬液接种至含有3 m L完全培养基的培养皿中,轻晃匀后将其放至培养箱中培养。每过2 4 h进行1次培养液更换,细胞汇合度达8 0%左右再做传代培养。用含H i T r a n s G P的转染液将完全培养基制成(35)1 04个m L-1细胞悬液,随之接种细胞悬液到培养板,直至细胞达到1 5%3 0%铺板量左右。铺板后无需培养,病毒按MO I=1 0进行转染。将各孔中转
21、染1 6 h后的细胞收集起来转移至1 2孔板中,并补加1 m L完全培养基,轻混匀后放至培养板继续培养。转染后1 2 0 h,细胞繁殖良好未出现大量的细胞死亡现象,N C组和C ON组具有相似的细胞状态,使用荧光显微镜观察标记基因的表达,荧光率即为病毒的阳性转染率。1.2.2 实时P C R检测R u n x2基因转录水平 收集转染细胞,2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n后吸除其中上清液,向沉淀物中加入1 m L T r i z o l并充分混匀,室温下静置5 m i n后转移至新E P管;反转录获得c D NA(使用M-ML V试剂盒),将2 L反转录引物与2.0 g T o
22、t a l R NA一 同 混 入P C R小 管 中,再 加 入R N a s e-F r e e H2O至1 1 L,混匀后进行离心,7 0 水浴1 0 m i n,立即对其进行冰浴退火。按比例配制反应体系,混匀后进行短暂离心。4 2 水浴中上述体系反应1 h后,7 0 水浴1 0 m i n令反转录酶失活,最后得到的反转录产物c D NA将置于-2 0 保存备用。2步法实时P C R并制作扩增曲线和熔解曲线,然后进行数据分析。所需引物由上海吉凯基因医学科技股份有限公司设计合成,见表1。表1 目的基因与内参基因引物T a b l e 1 P r i m e r s o f t a r g
23、e t g e n e a n d r e f e r e n c e g e n e基因引物序列扩增片段大小R u n x2上游A C C A T AA C C G T C T T C A C AAA下游G T T C C C GA G G T C C A T C T A C T8 2 b pG A P DH上游T GA C T T C AA C A G C GA C A C C C A下游C A C C C T G T T G C T G T A G C C AAA1 2 1 b p1.2.3 W e s t e r n B l o t检测R u n x 2蛋白表达水平 收集转染细胞,使用
24、P B S洗涤两次后加入R I P A,在冰上进行裂解1 0 m i n,刮下细胞转移到新E P管中,超声使细胞破碎,4、1 2 0 0 0 r p m离心1 5 m i n,利用B C A法测定离心后上清液蛋白的浓度。加入新裂解液使每个样品蛋白浓度调至2 g/L-1,加入1/5体积的6 X l o d d i n g b u f f e r并混匀,1 0 0 浴煮 1 0 m i n,短暂离心后保存在-8 0 备用。S D S-P AG E电泳,使用湿转法免疫印迹。室温下对P V D F膜封闭1 h,加入稀释后一抗R u n x 2(1 1 0 0 0)、-a c t i n(1 2 0 0
25、 0)4 孵育过夜,T B S T溶液洗膜,加入稀释后二抗(1 5 0 0 0)室温下孵育1.5 h,T B S T溶液洗膜,X光显影。利用I m a g e J软件分析图像中蛋白O D比值。1.3 统计学分析 采用S P S S 2 6.0软件进行统计学分析,实验组和对照组数据进行t检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 慢病毒转染效率 病毒转染1 2 0 h后,各组细胞状态相当,细胞未出现大量死亡;荧光显微镜观察标记基因表达,荧光率即为阳性转染率。N C组荧光表8821西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e
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