低聚木糖下调鼠伤寒沙门氏菌STM0306基因表达并抑制其黏附能力的作用.pdf
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1、生物技术2023年第44卷第17期 总第686期鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium,S.typhimurium)属于沙门氏菌种属(Salmonella spp.),是一种常见的革兰氏阴性人畜共患病原菌1。鼠伤寒沙门氏菌对动物具有极其广泛的致病性并且能够在动物低聚木糖下调鼠伤寒沙门氏菌STM0306基因表达并抑制其黏附能力的作用 凌 翀 于晓蕾 曹庆云 叶 慧 冯定远 左建军 王伟唯*(华南农业大学动物科学学院,广东省动物营养调控重点实验室,广东广州 510630)摘 要:试验旨在探究低聚木糖(xylooligosaccharides,XOS)对鼠伤寒沙门氏菌(Salm
2、onella typhimurium,S.typhimurium)黏附素基因表达及黏附能力的影响,为畜禽养殖中缓解沙门氏菌的感染提供基础。以IPEC-J2细胞为模型,探究了XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附能力的影响和黏附素STM0306基因表达的调控效果及机制。结果表明,XOS显著降低了鼠伤寒沙门氏菌对IPEC-J2细胞的黏附能力(P0.05);qRT-PCR结果表明,XOS处理导致鼠伤寒沙门氏菌黏附素基因STM0306表达量极显著降低(P0.01);进一步研究发现,XOS 处理后,鼠伤寒沙门氏菌培养基的 pH 显著降低(P0.05),Mg2+浓度显著提高(P0.05)。说明,XOS可能通过调控菌液
3、的Mg2+浓度在一定程度上抑制鼠伤寒沙门氏菌PhoP/PhoQ调控系统,进而抑制其下游基因STM0306表达,从而降低细菌对IPEC-J2细胞的黏附能力。关键词:低聚木糖;STM0306基因;鼠伤寒沙门氏菌;细菌黏附;黏附素doi:10.13302/ki.fi.2023.17.015中图分类号:S816.7 文献标识码:A 文章编号:1001-991X(2023)17-0086-06Study on The Effect of Xylooligosaccharides in Down-Regulating The STM0306 Gene Expressionand Inhibiting Th
4、e Adhesion Ability of Salmonella typhimuriumLING Chong YU Xiaolei CAO Qingyun YE Hui FENG Dingyuan ZUO Jianjun WANG Weiwei*(College of Animal Science,South China Agricultural University,Key Laboratory for Animal NutritionRegulation of Guangdong Province,Guangdong Guangzhou 510630,China)Abstract:The
5、experiment aims to investigate the effect of xylooligosaccharides(XOS)on the expression of the adhesin gene of Salmonella typhimurium(S.typhimurium)and its adhesion ability to host cells,and to provide a basis for the mitigation of Salmonella infection in livestock and poultry farming.We investigate
6、d the effect of XOS on the adhesion of S.typhimurium to IPEC-J2 cells,and on the regulation mechanism of the expression of the STM0306 gene.The results showed that XOS reduced the adhesion ability of S.typhimurium to IPEC-J2 cells(P0.05);qRT-PCR results showed that XOS treatment resulted in a reduct
7、ion in the relative expression of S.typhimurium adhesin gene STM0306(P0.01);further study revealed that the pH value of medium was reduced(P0.05)and the Mg2+concentration was increased(P0.05)after XOS treatment.It indicated that XOS might inhibit the PhoP/PhoQ regulatory system of S.typhimurium by r
8、egulating the Mg2+concentration of the bacterial solution,which in turn inhibits the expression of its downstream gene STM0306,thereby reducing the adhesion of S.typhimurium to IPEC-J2 cells.Key words:xylooligosaccharides;gene STM0306;Salmonella typhimurium;bacterial adhesion;adhesins作者简介:凌翀,硕士,研究方向
9、为动物营养与饲料科学。*通讯作者:王伟唯,副研究员,硕士生导师。收稿日期:2023-06-02基金项目:国家自然科学基金项目31872390、3210258486SILIAO GONGYE2023年第44卷第17期 总第686期产品(肉、蛋、奶等)中长期存活,对畜禽养殖和公共卫生安全具有重大威胁。与宿主上皮细胞的黏附是沙门氏菌感染起始也是最关键的一步,这种黏附通过细胞膜上的受体与细菌表面存在的多种黏附因子(菌毛和黏附素等)的相互作用来实现2。STM0306(又称PagN)是鼠伤寒沙门氏菌的黏附素之一,STM0306基因的表达主要受 PhoP/PhoQ 双组分调控系统调控,PhoP/PhoQ是沙
10、门氏菌重要的二元信号转导系统3。低聚木糖(xylooligosaccharides,XOS)是一类具有益生元活性的短链聚合物,是一种功能性寡糖,能够通过动物肠道细菌(如双歧杆菌)对其代谢所产生的代谢产物如短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)对肠道健康进行调控4。研究表明,XOS具有提高动物生产性能、改善肠道形态、改善肠道微生物组成和促进激素分泌等多种功能5-7。虽然关于XOS在动物生产上的研究已有大量报道,然而,其对畜禽致病菌毒力影响方面的研究仍较少。已有研究表明8,XOS能够抑制李斯特菌对Caco-2细胞的黏附并下调其黏附相关基因inlA和lap的表达。本
11、研究利用猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,探究XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附宿主肠道上皮细胞的影响,通过qRT-PCR对鼠伤寒沙门氏菌黏附素进行筛选,并进一步探索XOS调控鼠伤寒沙门氏菌黏附素基因表达的机制,为XOS在畜禽养殖中沙门氏菌感染的缓解提供参考依据。1 材料与方法1.1 试验材料试剂:低聚木糖(纯度95%)购自上海源叶生物科技有限公司。细 菌 培 养:鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 野 生 型 菌 株(ATCC14028),购自广东省微生物食品安全工程技术研究开发中心;LB肉汤培养基、技术琼脂粉和一次性细菌培养皿,购自广东环凯微生物科技有限公司;BIOG细菌RNA提取试剂盒,购自常州百代
12、生物科技股 份 有 限 公 司;HiScript Reverse Transcriptase(R222)和 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711),购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;鼠伤寒沙门氏菌特异性引物,购自北京擎科新业生物技术有限公司;镁浓度检测试剂盒(微量法),购自北京索莱宝科技有限公司。细胞培养:IPEC-J2猪小肠上皮细胞系由华南农业大学动物科学学院印遇龙院士课题组馈赠;高糖DMEM细胞培养基(美国Gbico)和无菌PBS(美国Hyclone),购自广州致邦生物有限公司;胰酶、双抗、胎牛血清(美国Gibco),购自广州昂科生物技术有限
13、公司;细胞培养皿、细胞培养板(美国Corning),购自上海百赛生物技术有限公司。1.2 细菌黏附能力的测定1.2.1 XOS、细菌、细胞共孵育黏附试验在 12 孔细胞培养板中接种 IPEC-J2 细胞,置于5%CO2,37 恒温培养箱中培养,待细胞生长至约90%时,更换培养基,加入PBS洗涤三次后的处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌菌液(1109 CFU/mL,MOI=100),同时在培养基中加入 XOS 至总浓度为20 mg/mL,对照组加入等体积 PBS,37 孵育 1 h后PBS 洗涤三次以去除未黏附的细菌,加入 1 mL 1%Triton-100常温30 min裂解细胞,将细胞裂解液充分
14、吹打混匀后进行倍比稀释,通过琼脂平板倒板法进行菌落计数,计算黏附细菌总数量。1.2.2 XOS预处理细菌、细胞黏附试验黏附试验方法同上,鼠伤寒沙门氏菌与IPEC-J2细胞均用20 mg/mL XOS进行预处理,处理方法如下。细菌预处理:在细菌培养过程中加入总浓度为20 mg/mL的XOS溶液,对照组加入等体积PBS,置于37 空气摇床培养至对数生长期,进行后续处理。细胞预处理:待12孔细胞培养板中的细胞生长至约80%时,弃培养基并用PBS洗涤细胞一次,加入新鲜培养基,并加入总浓度为20 mg/mL的XOS溶液,对照组加入等体积 PBS,轻摇混匀后置于 5%CO2,37 恒温培养箱中培养,待细胞
15、生长至约90%时进行后续处理。1.3 qRT-PCR培养鼠伤寒沙门氏菌并用20 mg/mL XOS对菌液进行处理,对照组加入等体积PBS。待细菌处于对数生长期,通过BIOG细菌RNA提取试剂盒提取鼠伤寒沙门氏菌总RNA并进行逆转录后,采用表1所示体系进行qRT-PCR,以鼠伤寒沙门氏菌DNA消旋酶亚基基因gyrA(DNA gyrase subunit A)作为内参,对获得的信号、数据进行处理,根据公式2-Ct计算目的基因相对于内参基因的比值以反映其表达丰度。引物信息见表2。表1 qRT-PCR反应体系组分cDNA10 mol/L上游引物10 mol/L下游引物SYBRdd H2O含量(L)2.
16、00.60.610.06.887生物技术2023年第44卷第17期 总第686期表2 引物序列引物STM0306STM0306gyrAgyrA序列(53)F:CCCTTGTGGTAGCCTGGTCR:GCCTTTAGCATCCGTCTCAF:CGGGATACAGTAGAGGGATAGCGGR:CACCAACGACACGGGCAGATT1.4 pH测定培养鼠伤寒沙门氏菌并添加 20 mg/mL XOS 溶液,置于37 空气摇床220 r/min培养,每隔2 h测定一次细菌培养液的pH,测定前将菌液进行离心以分离菌体与培养液。1.5 Mg2+浓度测定培养鼠伤寒沙门氏菌并添加 20 mg/mL XO
17、S 溶液,置于37 空气摇床220 r/min培养,每隔2 h测定一次培养液中的Mg2+浓度,离心后通过镁浓度检测试剂盒(微量法)测定Mg2+浓度。1.6 数据统计与分析使用SPSS 21.0对试验数据进行单因素方差分析。所有数据以“平均值标准差”表示,各组之间的差异使用Duncan s多重比较法进行检验。*表示组间差异显著(P0.05);*表示组间差异极显著(P0.01)。2 结果与分析2.1 XOS共孵育对鼠伤寒沙门氏菌黏附IPEC-J2细胞的影响如图1所示,与未加XOS组相比,XOS共孵育能够极显著抑制鼠伤寒沙门氏菌对IPEC-J2细胞的黏附(P0.01)。在共孵育处理体系中,XOS、鼠
18、伤寒沙门氏菌和IPEC-J2细胞三者同时存在,表明XOS能通过影响鼠伤寒沙门氏菌与IPEC-J2细胞之间的互作来抑制其对细胞的黏附作用。黏附细菌数(104个)低聚木糖处理组溶剂对照组100806040200*图1 XOS共孵育对鼠伤寒沙门氏菌黏附IPEC-J2细胞的影响(n=6)2.2 XOS预处理对鼠伤寒沙门氏菌黏附IPEC-J2细胞的影响为探究XOS单独处理细菌与细胞对细菌黏附的影响作用,通过20 mg/mL XOS分别对鼠伤寒沙门氏菌和IPEC-J2细胞进行预处理,测定细菌黏附能力。结果如图2所示,与未加XOS组相比,XOS预处理的鼠伤寒沙门氏菌对IPEC-J2细胞的黏附能力显著降低(P
19、0.05),但是黏附细菌数量在数值上有一定的降低;另外设置共孵育处理组,结果与2.1相同。表明除了参与细菌与细胞间的互作外,XOS还能够通过影响鼠伤寒沙门氏菌本身从而抑制其对细胞的黏附能力。黏附细菌数(104个)150100500*空白对照细菌+细胞+共孵育+*注:“+”表示XOS处理。图2 XOS预处理对鼠伤寒沙门氏菌黏附IPEC-J2细胞的影响(n=3)2.3 XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附素基因表达的影响为了探究XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附能力的影响是否与其黏附素基因的表达量变化有关,进行了qRT-PCR,结果如图 3 所示。通过基因筛选,发现XOS极显著下调了鼠伤寒沙门氏菌黏附素STM030
20、6基因的mRNA相对表达量(P0.01)(无显著性变化的基因结果未展示)。表明XOS可能通过影响鼠伤寒沙门氏菌STM0306基因表达进而影响其的黏附能力。mRNA相对表达量1.51.00.50*细菌对照组低聚木糖处理细菌组图3 XOS对鼠伤寒沙门氏菌黏附素基因表达的影响(n=6)2.4 XOS对鼠伤寒沙门氏菌培养液pH的影响鼠伤寒沙门氏菌 STM0306 基因的表达受 PhoP/PhoQ调控系统调控,该调控系统的活性主要受菌体88SILIAO GONGYE2023年第44卷第17期 总第686期细胞膜外的pH、Mg2+浓度和抗菌肽浓度的影响。由于XOS单独处理细菌的体系并不涉及宿主细胞,因此,
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