药用植物三叶青组织培养研究进展_林丽霞.pdf
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1、2023.3 经验交流三叶青(Terastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属的多年生草质攀缘藤本植物,又称蛇附子、金钱吊葫芦、三叶崖爬藤、土经丸、石老鼠等,是我国特有的珍稀药用植物1-3。生于山谷疏林中或阴处石壁上,分布于长江流域至南部各省份,福建、湖南、云南、广东、广西等地的三叶青为青藤三叶青,浙江、江西一带的三叶青则为紫藤三叶青4-5。三叶青味微苦、性平,以块根或全草入药,在民间有“药王”“抗癌神草”“植物抗生素”等美誉,用于治疗小儿高热惊厥、百日咳、肺炎、哮喘等症,具有抗癌、抗肿瘤、抗炎、镇痛、清热解毒及保肝等作用,且毒副作用小6-7。目前,对
2、三叶青的研究侧重于总黄酮提取工艺的优化及提取物的药效,尤其是抑制直肠癌、肝癌、皮肤癌等癌症细胞的生长8-10。随着三叶青药用成分更深入的研究与开发,野生三叶青远远满足不了市场逐年递增的需求,利用组织培养技术快速增殖瓶苗,可以在短时期内提供大量种苗。本文总结了近年来三叶青组织培养技术的研究进展,以期为建立高效、低成本三叶青组织快繁体系提供思路,为实现三叶青种苗大规模生产奠定基础。1外植体的来源与处理1.1外植体的选择在植物组织培养中,外植体的选择在很大程度上影响着无菌体系的建立。选择外植体时需考虑植物的品种、外植体的来源、取材的时间、材料的大小和消毒的难易等。目前,研究较多的三叶青组织培养材料主
3、要来自浙江省各个地区,如宁波、建德、台州、丽水、金华、富阳等,少数来自安徽、江西和福建等地11。在三叶青组织培养中,可使用茎尖、带芽茎尖、腋芽、带腋芽的茎段、不带腋芽的幼嫩茎段和叶片等作为外植体。钟毓倩等的研究12发现,选择三叶青不同部位外植体进行组织培养,效果最好的诱导外植体为茎尖。王静13分别以带芽茎尖、带腋芽的半木质化茎段为外植体进行组织培养,结果表明,带腋芽茎段诱导的无菌苗分枝较多、更健壮,而茎尖诱导的无菌苗叶片出现严重退化。陆飞彪等人14选取生长良好三叶青嫩叶为外植体进行愈伤组织诱导,建立了三叶青愈伤组织诱导增殖体系。目前,三叶青组织培养主要以带腋芽的茎段直接诱导不定芽,进而继代增殖
4、生根培养形成再生植株,以叶片为外植体诱导愈伤组织进行细胞悬浮培养。1.2外植体的消毒在组织培养中,培养基可能会被污染,所以外植体的消毒是组培的第1步,应根据所选外植体的污染程度选择适合的灭菌方式和灭菌时间。罗常荣15选带腋芽茎段为外植体,用洗洁精混合液(0.1%)浸泡30 min,再用流水冲洗30 min,使用75%酒精浸泡茎段5 min,接着用0.1%氯化汞(加23滴吐温)分别浸基金项目:厦门市重大科技计划项目(3502Z20211003)。作者简介:林丽霞(1989-),女,助理研究员,从事果树栽培与植物种苗繁育技术研究。E-mail:通讯作者:施建羽(1971-),男,副研究员,从事果树
5、栽培技术研究。E-mail:药用植物三叶青组织培养研究进展摘要:根据已报道的文献,对我国药用植物三叶青组织培养技术的研究进行归纳总结,从外植体的选择与消毒、培养基及植物生长调节剂的筛选、培养条件等方面进行阐述,以期为三叶青的种质资源保存及种苗工厂化生产提供理论参考。关键词:三叶青;组织培养;研究进展林丽霞林建忠赖瑞云张雪芹施建羽(福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点公共实验室福建厦门361006)150-经验交流 2023.3泡震荡3个时间水平(5 min、10 min、15 min),无菌水浸泡震荡冲洗5次,结果表明,震荡消毒10 min成活率最高(为53.92%)。符渊淼1
6、6也是以幼嫩带腋芽茎段为外植体,自用流水冲洗3060 min,在超净工作台上先用70%酒精浸泡1 min,再用加有23滴吐温的0.1%HgCl2溶液浸泡15 min,最后用无菌水洗涤5次,约78%外植体未污染。2培养基与植物生长调节剂的选择2.1培养基的筛选植物组培中常用的再生途径就是通过诱导腋芽或者不定芽进行器官的直接发生,再对其增殖培养。史清英17通过比较4种基本培养基(MS、1/2MS、WPM、B5)对三叶青芽诱导和丛生芽增殖的影响,发现1/2MS、WPM基本培养基对腋芽的诱导率明显较高,分别为84.67%、86.00%;而MS、B5基本培养基芽增殖系数较高,且MS、1/2MS基本培养基
7、有利于芽伸长。王静13以MS和1/2 MS为基本培养基诱导三叶青的不定芽,发现MS是初代苗的最佳诱导培养基;以MS、1/2 MS、3/4 MS为基本培养基进行侧枝的继代培养,发现MS为最佳增殖培养基。可见,以三叶青茎段为外植体,在初代培养基的选择上,一般采用1/2 M培养基或MS基础培养基,增殖培养基可选用MS作为基础培养基。三叶青的生根培养基一般采用1/2MS基本培养基,邵骏骅18以MS为生根培养基,其生根率也高达100%。此外,诱导植物外植体形成大量愈伤组织,可以在较短时间内通过愈伤组织分化形成不定芽或不定根。吴浩等19以不带腋芽的三叶青茎段为外植体,研究White、B5、MS 3种基本培
8、养基对愈伤组织诱导率及分化率的影响,结果表明MS基本培养基的诱导率最高,为96.7%,而以培养基B5最有利于不定芽的分化,分化率为66.7%。卢爱芳等20以无菌苗叶片诱导愈伤组织,试验结果表明最佳诱导培养基为2/3 MS,诱导率高达96%,而1/2 MS培养基最有利于三叶青愈伤组织分化为不定根。2.2植物生长调节剂对组培苗的影响2.2.1植物生长调节剂对诱导三叶青腋芽和愈伤组织的影响不同的植物生长调节剂对外植体脱分化和器官发生的作用不同,使用不同浓度的植物生长调节剂对外植体生长和分化的作用亦不同,因此需根据植物外植体的不同选择适宜的植物生长调节剂及浓度。在诱导三叶青腋芽发生的培养基中一般添加6
9、-BA、NAA、IBA等,通常采用6-BA和NAA、6-BA和IBA配合使用。钟毓倩等12的研究发现,初代培养的最佳激素配比为2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,诱导率为86%,罗常荣15同样以2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA的激素组合诱导腋芽,其诱导率仅为51.67%;而史清英17以较低浓度的6-BA(0.8 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)进行诱导,诱导率高达100%。吴浩等19采用2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA诱导不带腋芽的幼嫩茎段,诱导率为96.7%。钱丽华21的研究发现,2,4-D对三叶青叶片愈伤的诱导效应差,单一的6-B
10、A处理对三叶青叶片愈伤的诱导效应不理想。陆飞彪等14的研究表明,诱导愈伤组织的最佳激素组合为2.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L NAA,其诱导率为70%。此外,洪春桃22在诱导腋芽的培养基中添加了25%的活性炭。2.2.2植物生长调节剂对三叶青不定芽增殖的影响在不定芽的分化和增殖培养基中,常用6-BA和NAA的激素组合。陈加红23利用2.04.0 mg/L 6-BA和0.10.3 mg/L NAA增殖不定芽。彭昕等的研究24结果表明,利用2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/LIBA进行增值培养时芽的增殖效果最好。郑漫佳等的研究25结果表明,添加0.5 mg
11、/L BA可以显著提高芽增殖系数,最大可达8.47;同时,添加3 g/L水晶洋菜作为凝固剂,芽增殖系数最大为5.68,显著高于添加琼脂粉的各个处理,而添加琼脂粉的试管苗生长容易出现玻璃化。2.2.3植物生长调节剂对愈伤组织分化及试管苗生根的影响在生根培养基中,符渊淼16比较了4种植物生长调节剂(2,4-D、IAA、NAA和IBA)对不定芽的生根影响,结果发现IBA对不定芽的生根效果最好,且3种浓度(0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L)下生根率都达到100%。3培养条件3.1光照光照是植物组织培养中的重要条件之一,包括光质、光照度和光照周期。钱丽华等21探讨光质对三叶青愈伤组织
12、继代增殖的影响,结果表明红光与蓝光以91和73混合光源处理可提高三叶青愈伤干物质含量。通常条件下,三叶青愈伤组织的诱导、不定芽生长及细胞悬浮培养所需的光照度为2 000 lx,光照周期12 h/d。洪春桃等22以三叶青的嫩叶和腋芽151-2023.3 经验交流茎段为材料,建立了三叶青组织培养体系,光照度设为4 000 lx。3.2温度大多数植物组织培养是在2327的温度下进行,培养温度低于15时,组织就会停滞生长,超过35则不利于其生长甚至死亡。三叶青组织培养时一般培养温度为(252)。彭昕等24采用(262)的温度诱导三叶青丛生芽、增殖培养并获得完整植株。钱丽华等21探讨了不同温度对三叶青愈
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