传统泡菜中高产酸乳酸菌的筛选与鉴定.pdf
《传统泡菜中高产酸乳酸菌的筛选与鉴定.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《传统泡菜中高产酸乳酸菌的筛选与鉴定.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 96 传统泡菜中高产酸乳酸菌的筛选与鉴定 郑琦锴,蔡常宇,王临好,廖振林*(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)摘要:以湖南地区家庭自制50 余年泡菜液为样品,采用纯培养方法分离纯化得到乳酸菌。对分离得到的乳酸菌进行溶血活性检验,产酸性能测定,并研究高产酸菌株的耐酸耐胆盐、自聚集疏水性、抗氧化、降解亚硝酸盐、生长特性及生物安全性研究。结果表明,从泡菜样品中分离出来70 株乳酸菌,检验出完全无溶血活性乳酸菌 42 株;筛选出高产酸性能乳酸菌9 株,编号为JT1-31、J
2、T1-21、JT1-12、JT1-25、JT1-6、JT1-16、JT1-34、JT3-23、JT3-10,通过16S rDNA 鉴定,均为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum),菌株JT1-12 耐酸性最好,pH 值3.0 时存活率为156.85%;菌株JT3-10 耐胆盐能力最好,0.3%胆盐浓度存活率为145.04%;菌株JT1-16自聚集和疏水性最高,分别为66.13%和44.19%;菌株JT1-21 的DPPH 清除率最高,为51.93%;菌株JT1-25 的-葡萄糖苷酶抑制率最高,为20.36%;9 株菌株亚硝酸盐降解率都较高,在90%以上,清除
3、率最高的菌株是JT1-12,清除率为94.98%,通过产生物胺鉴定,9株菌株均不产生物胺。该研究表明,从传统泡菜中分离的9株植物乳植杆菌具有良好的益生潜能,为发掘食品源乳酸菌提供参考和依据。关键词:乳酸菌;泡菜;产酸;植物乳植杆菌;筛选 文章编号:1673-9078(2023)09-96-105 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.9.1092 Screening and Identification of High Acid-producing Lactic Acid Bacteria in Traditional Kimchi ZHENG Qikai,CA
4、I Changyu,WANG Linhao,LIAO Zhenlin*(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)Abstract:Hunan homemade kimchi water that had been stored for more than 50 years was used for screening and isolating strains of lactic acid bacteria using the culture-dependent met
5、hod.The isolated strains were examined for their hemolytic activity and acid generation ability,whereas the high acid-producing strains were assessed for their tolerance to acid and bile salts,self-aggregation and hydrophobicity,antioxidant properties,nitrite degradation ability,growth properties,an
6、d biosafety.In total,70 lactic acid bacterial strains were isolated from the kimchi samples,of which 42 did no exhibit hemolytic activity.Additionally,16S rDNA sequence was used to screen and identify nine high acid-producing strains,which were designated JT1-31,JT1-21,JT1-12,JT1-25,JT1-6,JT1-16,JT1
7、-34,JT3-23,and JT3-10.They all belonged to Lactiplantibacillus plantarum;strain JT1-12 showed the best acid resistance,with a survival rate of 156.85%at pH 3.0;strain JT3-10 exhibited the best bile salt tolerance,with a survival rate of 145.04%at 0.3%bile salt concentration;strain JT1-16 showed the
8、highest self-aggregation and hydrophobicity at 66.13%and 44.19%,respectively;and strain JT1-21 exhibited the highest DPPH scavenging rate at 51.93%.The-glucosidase inhibition rate of strain JT1-25 was the highest at 20.36%.The nitrite degradation rate of all nine strains was 90%,with JT1-12 exhibiti
9、ng the highest removal rate at 94.98%.Evaluation of biogenic amine production indicated that none of the nine strains produced biogenic amines.This study identified nine strains of lactic acid bacteria isolated from traditional kimchi that exhibited good probiotic potential,providing a valuable refe
10、rence and foundation for further inviestigation into lactic acid bacteria derived from food sources.Key words:lactic acid bacteria;kimchi;acid production;Lactiplantibacillus plantarum;screening 引文格式:郑琦锴,蔡常宇,王临好,等.传统泡菜中高产酸乳酸菌的筛选与鉴定J.现代食品科技,2023,39(9):96-105 ZHENG Qikai,CAI Changyu,WANG Linhao,et al.S
11、creening and identification of high acid-producing lactic acid bacteria in traditional kimchi J.Modern Food Science and Technology,2023,39(9):96-105 收稿日期:2022-08-31 基金项目:广东省重点研发计划项目(2020B020226008;2018B020206001)作者简介:郑琦锴(1997-),男,硕士研究生,研究方向:益生菌,E-mail: 通讯作者:廖振林(1968-),男,博士,教授,研究方向:益生菌、菌群与健康,E-mail:
12、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 97 泡菜是一种中国传统的发酵蔬菜食品,富含维生素、矿物质、有机酸和乳酸菌1,乳酸菌的作用包括 抑制有害微生物的生长繁殖及产生独特的风味物质,对发酵泡菜的品质有着重要影响2。蔬菜发酵后风味会得到改善,保藏期会延长3。任亭等4通过从涪陵本地传统泡菜中分离筛选出 1 株魏斯氏菌(Weissella),与植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)结合纯种发酵麻竹笋泡菜,发现纯种发酵总酸含量明显高于自然发酵,风味评定发现纯种发酵分为评分明显高于自然发酵组
13、,改善了酸菜的口感。乳酸菌除了对泡菜的风味有重要影响外,在发酵中也有着各种益生作用,产生多种有益物质,如高产酸能力5、抗氧化6、降解亚硝酸盐7、产-氨基丁 酸8和降解生物胺9。许多学者从泡菜中分离出各种功能的乳酸菌。赵鑫等10从泡菜中分离出两株高抗氧化性能的乳酸菌,分别为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(Z2)、植物乳植杆菌(Z5)。刘义等11从泡菜中分离出一株产细菌素乳酸菌 QH 18-4,对大肠杆 菌(Escherichia coli)、金 黄 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica
14、)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、绿脓假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)有不同程度的抑制作用。吕嘉枥等12从发酵果蔬中分离了 18 株抑制-葡萄糖苷酶的乳酸菌,最高抑制率为 37.48%。所以,泡菜中有许多优良功能的乳酸菌,对泡菜中乳酸菌进行研究,有巨大前景。以传统发酵食品为研究对象,筛选出有益乳酸菌能控制食品发酵中的有益物质成分,了解发酵过程中的动态变化,对食品发酵工业的未来发展有重要意 义13-15。本研究以湖南省地区家庭自制有
15、 50 余年历史的泡菜液为样品,采用分离培养方法鉴定乳酸菌,再对分离得到的乳酸菌进行溶血活性检验,产酸性能测定,并研究高产酸菌株的生长特性、耐酸耐胆盐、自聚集能力、疏水性、抗氧化、降解亚硝酸盐及生物安全性等,为挖掘传统发酵食品中乳酸菌资源奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 原料 取自湖南洞口两个家庭自制泡菜液,发酵起始于1968 年,用无菌瓶包装,于 4 保藏。1.1.2 培养基 MRS 液体培养基:蛋白胨 10 g/L,牛肉膏 10 g/L,酵母粉 5 g/L,葡萄糖 20 g/L,硫酸镁0.1 g/L,硫酸锰0.05 g/L,柠檬酸三铵 2 g/L,无水乙酸钠 5 g/L,
16、磷酸氢二钾 2 g/L,吐温 80 1 g/L,用三级水溶解。MRS固体培养基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母粉5 g/L,葡萄糖20 g/L,硫酸镁0.1 g/L,硫酸锰0.05 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,无水乙酸钠5 g/L,磷酸氢二钾2 g/L,吐温80 1 g/L,琼脂15 g/L,用三级水溶解。CaCO3-MRS 固体培养基:蛋白胨 10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母粉 5 g/L,葡萄糖 20 g/L,硫酸镁 0.1 g/L,硫酸锰 0.05 g/L,柠檬酸三铵 2 g/L,无水乙酸钠 5 g/L,磷酸氢二钾 2 g/L,吐温80 1 g/L,CaCO3 10
17、 g/L,用三级水溶解。1.1.3 主要试剂 NaOH、DPPH、盐酸萘乙二胺、硼砂、乙酸锌、亚铁氰化钾、对氨苯磺酸、亚硝酸钠、NaCl、HCl、DPPH:国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。1.1.4 仪器与设备 XMTD-204 数显式电热恒温水浴锅,欧诺仪器仪表有限公司;电子天平 ME204E,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Centrifuge 5810R 高速离心机:Eppendorf AG;SPX-250B生化培养箱,广州市叁科仪器有限公司;SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司;Sartorius 普及型 pH 计(PB-10),赛
18、多利斯科学仪器(北京)有限公司。1.2 实验方法 1.2.1 乳酸菌分离与鉴定(1)菌株分离:取 4 种泡菜发酵液样品各 1 mL,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,取各梯度100 L稀释液均匀涂布于 CaCO3-MRS 固体培养基上,每个梯度做三个平行,置于 37 恒温箱中培养 48 h。选取有溶钙圈的单菌落,观察菌落形态并从平板上挑选形态、大小、颜色不同的菌落,在 MRS 固体平板上纯化直至单菌落。把筛选得到的单一菌株用 20%甘油保存,存放于-80 备用。(2)形态观察:观察分离菌株的菌落形态,并按照革兰氏染色法进行染色,然后调节双目显微镜于100 倍的油镜下观察其形态。(3)分子鉴定:
19、纯化得到的单菌落进行16S rDNA鉴定,使用 SDS 法提取菌株 DNA。吸取 1 mL 培养12 h 的菌液,10 000 r/min 离心 5 min,倒掉上清液,加入 1 mL 无菌水吹打均匀,继续用10 000 r/min 离心5 min,去掉上清液;往菌体中加入 10 L 的 1%(m/V)现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 98 SDS,震荡 8 min,加入 490 L 无菌水,手动摇匀,作为 PCR 扩增模板备用,之后用引物 27F(5-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3)和 149
20、2R(5-TACGGY TACCTTGTTAYGACTT-3)进行 PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳法检测 PCR 产物。对在 1 400 bp 附近有明亮条带的扩增 DNA 样品送至广州擎科生物技术有限公司进行测序,将测序结果提交至NCBI(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST 同源性比对,选取同源性较高的模式菌株16S rDNA 序列,采用MEGA 10.0 软件中的邻接法(Neighbor Joining,NJ)构建系统发育树。1.2.2 乳酸菌生长曲线测定 将乳酸菌活化三代,按 2%(V/V)的接种量接种到装有 MRS 培养基的生长曲线仪微孔板中,放
21、在生长曲线仪中 37 培养24 h,每隔 30 min 测一次吸光度,每株菌三个平行。1.2.3 无溶血活性乳酸菌的筛选 取初筛得到的保存于甘油管中的乳酸菌,进行培养,培养三代以上,吸取培养的菌液 10 L 在血平板上点样,每株菌点样 3 次,观察有无溶血圈。1.2.4 乳酸菌产酸能力 取筛选得到的无溶血活性的乳酸菌进行产酸性能试验。取保藏于甘油管中的乳酸菌按 2%(V/V)的接种量接种到 MRS 液体中,37 培养 24 h,总共活化三代。取活化三次的乳酸菌液体按 2%接种量接种到MRS 液体培养基中,37 培养 48 h,取培养 48 h 的菌液离心,用上清液通过酸碱滴定法测乳酸菌产酸量并
22、测定 pH 值,每株菌做 3 个平行。通过酸碱滴定结果和 pH 值选出产酸多的菌株。酸度值测定:取 1 mL 发酵好的上清液稀释 6 倍,加入 12 滴(10 g/L)酚酞指示液,用 0.1 mol/L 的氢氧化钠标准溶液滴定,滴定至为红色,且 30 s 不褪色,即为滴定终点,记录下消耗的氢氧化钠体积,以消耗的氢氧化钠体积来计算酸度值(酸度值以乳酸计),以未接种的 MRS 液态培养基为空白,总酸的含量按下式计算:()121000cKFXVmV=(1)式中:X总酸的含量,g/kg 或 g/L;c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,mol/L;V1滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,mL;V2空白试
23、验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,mL;K酸的换算系数:乳酸,0.09;F试液的稀释倍数;m试样的质量,g;或吸取试样的体积,mL。1.2.5 乳酸菌耐酸耐胆盐性能(1)耐酸:综合参考张会生等16和 Abolfazl 等17的方法。将乳酸菌接种于 5 mL MRS 液体培养基中,放置于 37 恒温培养箱,培养 12 h,活化三代。将该培养液在4、4 000 r/min 条件下离心 5 min,弃上清,用无菌生理盐水洗涤 2 到 3 次,取对应 pH 浓度(pH值 2.5 和 3.0)的 5 mL 液体培养基重新悬浮,震荡均匀,放入37 培养箱培养,分别在 0、4 h 取培养液稀涂布样于 MR
24、S 固体培养基中,37 培养 24 h,计数菌落生长情况,每株菌做 3 个平行,检测菌株耐酸情况,耐酸率按下式计算。100%BXA=(2)式中:X酸耐受性能;B4 h 的菌落数,CFU/mL;A0 h 的菌落数,CFU/mL。(2)耐胆盐:综合参考张会生等16和 Abolfazl等17的方法,略作修改。乳酸菌接种于 5 mL MRS 液体培养基中,放置于 37 恒温培养箱,培养 12 h,活化三代。将该培养液在 4、4 000 r/min 条件下离心5 min,弃上清,用生理盐水洗涤 2 到 3 次,取对应胆盐浓度(0.30%和 0.10%)的 5 mL 液体培养基重新悬浮,震荡均匀,放入 3
25、7 培养箱培养,分别在 0、4 h取培养液稀释涂布于 MRS 固体培养基中,37 培养24 h,计数菌落生长情况,每株菌做 3 个平行,检测菌株耐胆盐情况,耐胆盐率按下式计算。100%BXA=(3)式中:X胆盐耐受性能;B4 h 的菌落数,CFU/mL;A0 h 的菌落数,CFU/m。1.2.6 乳酸菌自聚集能力测定 取培养三代的乳酸菌发酵液分装于离心管中,在4 000 r/min 条件下离心 8 min,弃去上清液,收集菌体沉淀,再加入等量无菌PBS缓冲溶液洗涤,反复洗涤两次,弃去上清液,加入无菌PBS缓冲溶液调整OD600 nm至 0.60。置于37 条件下培养 24 h,并在第 0、2、
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 传统 泡菜 中高 酸乳 筛选 鉴定
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。