紫檀芪通过线粒体途径调控结直肠癌细胞增殖和凋亡_李扬波.pdf
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1、基金项目:湖北省重点研发计划项目(2020BCA066)作者单位:430060武汉大学人民医院消化内科通信作者:董卫国,电子信箱:dongweiguo 紫檀芪通过线粒体途径调控结直肠癌细胞增殖和凋亡李扬波董卫国摘要目的探讨紫檀芪对结直肠癌细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法使用梯度浓度的紫檀芪体外处理结直肠癌细胞,CCK-8 法检测结直肠癌细胞增殖和活性,Hoechst 33258 荧光染色法检测细胞凋亡,DCFH-DA 荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化,JC-1 荧光探针检测细胞内线粒体膜电位的变化,Western blot 法检测线
2、粒体途径相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,紫檀芪对结直肠癌细胞增殖有抑制作用,且呈剂量和时间依赖性(P 0.05);Ho-echst 33258 染色和流式结果显示,紫檀芪促进结直肠癌细胞凋亡(P 0.05);紫檀芪诱导细胞内 ROS 产生、降低线粒体膜电位水平(P 0.05),增加 Apaf-1、AIF、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 的表达,降低 Bcl-2、PCNA 和 survivin 的蛋白水平(P 0.05)。结论紫檀芪增加结直肠癌细胞内 ROS 水平、降低线粒体膜电位水平,通过线粒体途径抑制结直肠癌细胞增殖,诱导结
3、直肠癌细胞凋亡。关键词紫檀芪结直肠癌细胞线粒体途径中图分类号R73文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.02.009Pterostilbene Regulates Proliferation and Apoptosis through Mitochondrial Pathway in Colorectal Cancer Cells.LI Yangbo,DONGWeiguo.Department of Gastroenterology,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei 430060,ChinaAbstr
4、actObjectiveTo investigate the effect and mechanisms of Pterostilbene on proliferation and apoptosis of colorectal cancercells.MethodsColorectal cancer cells were treated with Pterostilbene at gradient concentration in vitro,the proliferation and activity ofcolorectal cancer cells were detected by C
5、CK-8 assay,cell apoptosis was detected by Hoechst 33258 fluorescence staining,the changesof intracellular reactive oxygen species(ROS)were detected by DCFH-DA fluorescence probe,and the changes of intracellular mito-chondrial membrane potential were detected by JC-1 fluorescence probe,the expression
6、 levels of mitochondrial pathway-related proteinswere detected by Western blot.ResultsCompared with the control group,Pterostilbene inhibited the proliferation of colorectal cancercells in a dose-and time-dependent manner(P 0.05).The result of Hoechst 33258 staining and flow cytometry showed thatPte
7、rostilbene promoted the apoptosis of colorectal cancer cells(P 0.05).Pterostilbene could increase the intracellular ROS and de-crease the mitochondrial membrane potential(P 0.05),increase the expressions of Apaf-1,AIF,Bax,Cyt C,cleaved caspase-3and cleaved caspase-9,and decrease the protein levels o
8、f Bcl-2,PCNA and survivin(P 0.05).ConclusionPterostilbene can in-crease the level of intracellular ROS,decrease the level of mitochondrial membrane potential,which can inhibit the proliferation of color-ectal cancer cells and induce apoptosis of colorectal cancer cells through the mitochondrial path
9、way.Key wordsPterostilbene;Colorectal cancer cells;Mitochondrial pathway结直肠癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,根据世界卫生组织 2020 年发表的数据,结直肠癌发生率在世界恶性肿瘤排行表中居第 3 位,而且全球死亡病例数超 93 万例,仅次于肺癌1。中国仍是结直肠癌高发国家,2015 年新发病例数和死亡病例数分别为388000 和 187000 例2。尽管现代诊疗技术在癌症治疗领域取得了巨大进展,但是结直肠癌容易转移,86%的终末期结直肠癌患者会在确诊 5 年内死亡3。目前,结直肠癌的主要治疗方式是手术和联合放化疗,但是由
10、于化疗药物如 5-氟尿嘧啶耐药性问题日益严重,导致治疗效果不尽人意。因此,有必要寻找新型低毒且高效的天然抗癌药物,构建新的化疗方案,避免结直肠癌耐药性问题的进一步恶化。紫檀芪是最初从紫檀心材中分离出来的植物代谢产物,广泛存在于蓝莓、葡萄等浆果中。紫檀芪是白藜芦醇的天然类似物,但是比白藜芦醇具有更强的亲脂性和更高的细胞摄取潜力4。紫檀芪具有广泛的药理作用,如抗炎、降低血糖血脂以及营养神经等作用。既 往 研 究 证 实,紫 檀 芪 可 对 乳 腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤发挥治疗作用,但对14医学研究杂志 2023 年 2 月第 52 卷第 2 期论著结直肠癌的抗癌作用机制尚不明确5 8。本研究
11、探讨了紫檀芪在结直肠癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及其机制。材料与方法1.实 验 材 料:人 结 直 肠 癌 细 胞 株 SW480、HCT116、DLD-1 和人结肠上皮细胞 NCM460 购自中国典型培养物保藏中心;紫檀芪购自美国 Selleck 公司;胎牛血清、RPMI-1640 培养基购自美国 Gibco 公司;青霉素、链霉素、CCK-8 试剂盒、Hoechst 33258染色试剂盒、ROS 检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公司;Apaf-1、AIF、Bax、
12、Bcl-2、Cyt C、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GAP-DH、PCNA、survivin 兔单克隆抗体购自美国 Cell Sig-naling Technology 公司。2.细胞培养和分组:人结直肠癌细胞株(SW480、HCT116、DLD-1)和人结肠上皮细胞 NCM460 在质量浓度为 100g/L 胎牛血清、1%抗生素溶液(青霉素100U/ml 和链霉素 100g/ml)的 RPMI-1640 培养基,37、体积分数为 5%的 CO2加湿培养箱中培养。选用处于对数生长期的细胞进行实验,分为梯度浓度紫檀芪处理组和阴性对照组,阴性对照组加入同
13、浓度的DMSO。3.细胞增殖实验:用 CCK-8 试剂盒检测细胞活力。将细胞(5 103个/孔)接种在 96 孔培养板中,第 2 天更换上清液,在含有紫檀芪(0、10、20、40、60、80、120、160mol/L)的 新 鲜 培 养 基 中 培 养 12、24、48h。每孔加入 CCK-8 溶液 10l,再孵育 2h,用酶标仪测定 450nm 处的吸光度(A)值。4.Hoechst 33258 荧 光 染 色 法:利 用 Hoechst33258 染色试剂盒检测细胞凋亡。将处于指数生长期的细胞种植于 6 孔板,培养 24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80mol/L)的新鲜培养基培养 2
14、4h,然后固定细 胞,用 PBS 冲 洗 3 次,按 照 说 明 书 用 Hoechst33258 染色液染色。在荧光显微镜下观察和捕捉细胞凋亡的形态学特征。5.Annexin V-PE/7-AAD 双染流式细胞术:利用 Annexin V-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。将处于指数生长期的细胞种植于 6 孔板,培养 24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80mol/L)的新鲜培养基培养 24h,收集每孔细胞,PBS 冲洗两遍,离心收集细胞沉淀,按照说明书设置单染组和双染组,单染组只加 5l Annexin V-PE 或 7-AAD,双染组两者均加,置于室温避光孵育 15mi
15、n,随后用流式细胞仪检测。6.ROS 测定实验:利用 ROS 检测试剂盒测定细胞内 ROS 水平。将细胞接种于 6 孔培养板,培养 24h后用不同浓度的紫檀芪(0、20、40、80mol/L)再培养24h。细胞在含 10mol/L DCFH-DA 的 1ml 培养基中 37 培养 20min,用 PBS 洗涤 3 次。然后用荧光显微镜观测。7.线粒体膜电位测定实验:利用带有 JC-1 探针的线粒体膜电位检测试剂盒测定细胞线粒体膜电位。将细胞接种于 6 孔培养板,培养 24h 后用不同浓度的紫檀芪(0、20、40、80mol/L)再培养 24h。次日去除上清液,并用 JC-1 染料处理细胞 1h
16、,最后使用流式细胞仪检测和分析细胞。8.Western blot 法检测:经上述紫檀芪处理后,提取细 胞 总 蛋 白,测 定 蛋 白 浓 度。蛋 白 质 经 10%SDS-PAGE 电泳分离后,转膜,含浓度为 5%的脱脂牛奶 TBST 中 室 温 封 闭 1h,TBST 清 洗 4 次,每 次5min。随后 4 下一抗孵育过夜,TBST 清洗 4 次后,在室温黑暗条件下二抗孵育 1h,再用 TBST 洗涤 4次,最后用 Odyssey 红外荧光扫描成像系统扫描。9.统计学方法:应用 SPSS 21.0 统计学软件对数据进行统计分析。数据以均数 标准差(x s)表示,组间比较采用方差分析,以 P
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