土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究.pdf
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1、采用稀释涂布平板法分离到放线菌;用纸片法初步筛选出抑菌放线菌,生长速率法对抑菌效果好的菌株复筛;用经典分类学方法:插片法、形态学特征、培养特征、生理生化特征对菌株进行初步鉴定;通过对蚯蚓进行解剖和体表观察,对蚯蚓进行初步鉴定。试验所用的蚯蚓为环毛蚓属(Pheretimatschiliensis)动物。共分离出43株放线菌,有15株放线菌对供试菌病原菌有抑菌活性,其中菌株T13对供试病原细菌和真菌都有抑菌活性,且菌株 T13 的热稳定性较好,初步鉴定菌株 T13 为链霉菌属(Streptomycetaceae)放线菌,其在改良的高氏2号培养基中抑菌活性高,最优发酵时间为6 d,有耐热性。关键词
2、抑菌放线菌;发酵条件;稳定性;特征观察中图分类号 Q81文献标识码 Adoi:10.3969/j.issn.1674-9340.2023.02.016文章编号 1674-9340(2023)02-0101-08收稿日期:2023-04-06第一作者简介:晏爱芬(1976),女,汉族,云南宣威人,硕士,副教授,研究方向为微生物。放线菌(actinomycetes)其菌丝体为放射状1,自然分布广泛,主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、水、动植物和真菌体内。人们依据不同的研究目的,从多种动物体内分离到了大量的共生放线菌,为医药和工业生产提供宝贵的先导化合物资源。王影姣等2从美洲大蠊肠道中分离到种类较多的
3、共生放线菌,其中戈登菌等多种菌株都有较好的抑菌效果,并研究表明戈登菌在美洲大蠊抵抗外界恶劣环境时发挥着非常重要的作用。郭志凯等3从中华稻蝗肠道中发现一株共生放线菌,其能代谢出多种抗肿瘤细胞活性的化合物。矫继峰等4从新疆驴盲肠分离到大量放线菌,其中丙酸杆菌属放线菌占总微生物数量的30%,且对一些致病菌有抑菌作用,不仅促进了新疆驴对其食用的粗材料的吸收,而且对新疆驴的健康也起着重要作用。王容等5从南海紫海胆肠道中分离放线菌,其中有1株为稀有放线菌小单胞菌(Micromonospora sp.HDa2),并从该放线菌中分离到次生代谢产物,经鉴定为6个环二肽化合物,其中有4个化合物有相关的报道,具有较
4、强的抑菌活性。刘雪连等6从蚯蚓粪中分离出对大肠杆菌具有抑菌作用的菌株,胡艳霞等7从蚯蚓粪中分离到对蔬菜幼苗病害具有防控作用的菌株。另外,袁向华等8研究表明,蚯蚓通过吞食土壤使其有机质、有效磷、氮、钾等含量明显增加,显著增强了土壤的肥力。大量的试验研究表明动物消化道中的微生物与机体相互作用为人类生活带来了很大的益处。本试验从保山市隆阳区耕地土壤中的蚯蚓中分离抑菌放线菌,并通过形态学特征、培养特征、生理生化特征对菌株进行初步鉴定,对抑菌菌株进行发酵条件研究,为肠道放线菌的开发利用提供一定的理论依据,增加蚯蚓肠道放线菌的研究价值。1 试验材料与方法1.1 试验材料1.1.1 样品保山市隆阳区耕地土壤
5、中的蚯蚓(25841.24N,99951.90E)。第 42 卷第 2 期保山学院学报2023 年 4 月1.1.2 供试菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、白假丝酵母(Candida albicans)。均为保山学院微生物实验室提供。1.1.3 培养基高氏1号培养基;牛肉膏蛋白胨培养基;PDA培养基9。1.2 试验方法1.2.1 蚯蚓消化道研磨液的制备取耕地土壤中肥大的蚯蚓并让其不食土壤6 h,以确保放线菌是来自于蚯蚓的消化道而不是蚯蚓刚食用而未消化的土壤。用75%
6、乙醇在蚯蚓体表消毒,用无菌水洗3次,洗去酒精10,解剖找到蚯蚓的沙囊,把蚯蚓的消化道分为2节:从口、口腔、咽喉、食管、砂囊为一节,肠道为另一节。两部分消化道分别放入灭过菌的培养皿中,并在28的烘箱内进行干燥加热处理36 h后,用研钵分别将其碾成粉末。称取3 g消化道粉末加入到锥形瓶,再向锥形瓶加入灭菌玻璃珠和27 mL、0.9%灭菌生理盐水。放入恒温培养箱40,140 r/min震荡1 h,使其充分混匀。1.2.2 放线菌的分离吸取1 mL消化道研磨液加入装有9 mL无菌生理盐水的试管中,逐步稀释成10-1、10-2、10-3倍稀释液,取0.4 mL各稀释液涂布在倒有改良高氏2号培养基培养皿上
7、11,放在28恒温培养箱培养9 d,每个浓度重复3次。用高氏1号培养基划线接种改良高氏1号培养基上长出的放线菌10,纯化培养放线菌放于4冰箱保存。1.2.3 放线菌发酵液的制备取2 mL孢子悬液12接种于高氏1号液体培养基中,放于恒温培养箱28,170 r/min培养8 d,取1 mL培养液放入1.5 mL塑料离心管中10 000 r/min离心10 min。离心上清液用0.22 m滤膜过滤,滤液作为发酵液或无细胞发酵液置于4 冰箱保存。1.2.4 抑菌放线菌的筛选用滤纸片法筛选抑制细菌的放线菌:将指示菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种于试管液体培养24 h。用移液器各吸取0.2 m
8、L 菌液,均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上,待35 min 菌液干燥后,用灭菌镊子夹取4个滤纸片(直径5 mm)等距离贴于涂有指示菌的牛肉膏蛋白胨培养基上,再用无菌移液枪吸取100 L的发酵液分别滴在3个滤纸片上,另一个滴上无菌水作对照,各平板做好标记,每个指示菌做三个重复,平板倒置放于培养箱37恒温培养,培养 1224 h 后观察并测量抑菌圈直径,抑菌圈直径的大小表示待测菌株抑菌活性的大小13。采用生长速率法14筛选抑制真菌的放线菌:取1 mL放线菌发酵液加入到15 mL灭菌并冷却到45左右的PDA培养基中混匀,待培养基冷却凝固后,将培养好的指示真菌菌块(d=5 mm)贴于培养基的正中,每个重
9、复3次,置于28恒温培养57 d,以未加发酵液的作对照,待对照菌落长到直径在6070 mm时,采用十字交叉法测量菌落直径,并计算抑制率。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径1001.2.5 放线菌的初步分类和鉴定1.2.5.1 培养特征观察将分离纯化的放线菌转接到高氏一号固体培养基上,28恒温培养,分别5 d、10 d观察记录菌株在培养基上的菌落形态、颜色变化和生长情况。1.2.5.2 形态学特征观察采用插片法9进行观察。用灭菌镊子将灭菌盖玻片以45度角斜插入培养基,再将放线菌-102晏爱芬,何寒霞:土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究接种在插盖玻片一侧
10、的培养基上,28恒温培养57 d,用镊子小心取出盖玻片,无菌一面放在载玻片上显微观察。主要观察气生菌丝、基内菌丝和孢子丝、孢子排列方式、孢子形态及大小。1.2.5.3 生理生化特征的研究菌株的生理生化特征参考徐丽华等1的方法进行。1.2.6 发酵条件的研究以下实验均采用白假丝酵母作为指示菌。1.2.6.1 发酵培养基对发酵液抑菌活性的影响本实验通过配制3种不同的液体培养基,分别取25 mL装入100 mL的锥形瓶中,接种抑菌放线菌,置于28,180 r/min摇床恒温培养6 d后,测抑菌率。1.2.6.2 培养时间对发酵液抑菌作用的影响取25 mL发酵培养基加入到100 mL的锥形瓶中,接种抑
11、菌放线菌,置于28,180 r/min摇床培养,分别在第4,5,6,7,8 d取样测抑菌率。1.2.6.3 温度对发酵液抑菌活性的影响本实验取pH为7.0的25 mL发酵培养基装入100 mL锥形瓶中,接种抑菌放线菌,分别置于24,28,32,36,180 r/min摇床培养6 d后,测抑菌率。1.2.6.4 pH对发酵液抑菌活性的影响利用氢氧化钠(1 mol/L)和盐酸(1 mol/L)将筛选到的液体发酵培养基的pH调至5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,各取25 mL不同初始pH值的培养基装入100 mL锥形瓶中,接种抑菌放线菌,置于28,180 r/min摇床培养6 d后,
12、测抑均率。2 结果与分析通过对蚯蚓进行体表和解剖观察,本试验所用蚯蚓为环毛蚓属(Pheretima tschiliensis)环节动物(见图1)。图1 蚯蚓消化道的组成(A)及其体表特征(B)2.1 放线菌的分离从蚯蚓口部到沙囊这一段消化道中分离出17株放线菌,如表1所示,其中能把培养基染上相应的颜色1即产水溶性色素的有3株,菌落表面有水珠的有5株。从肠道中分离出26株放线菌,如表2所示,其中能产水溶性色素1的菌株有2株,菌落表面有水珠的菌株有13株。两部分消化道所分离出的放线菌有相似菌株:菌株T2和C16的菌落在形态和正反面的颜色有相似之处。-103第 42 卷第 2 期保山学院学报2023
13、 年 4 月表2 从C1C26的放线菌菌落特征菌株编号C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C24C25C26气生菌丝深灰淡棕色灰白色淡灰色浅灰色淡灰色黄灰色淡灰色银灰色深灰色淡灰色乳灰色淡灰色乳灰色白色微绿黄色白色灰白色深灰色浅红色棕黑色灰白色浅灰色白色灰蓝色橙灰色即内菌丝微褐黄色棕黑色淡黄色淡棕色乳黑色浅褐色乳褐色棕黑色淡棕色棕色浅褐色白黄色浅黑色乳白色黑色乳褐色浅棕色乳棕色浅棕色浅红色棕黑色乳棕色乳褐色暗蓝深蓝色黑红色可溶性色素-浅棕色-深蓝色-生长状况良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良
14、好良好良好良好良好良好较差较差良好良好良好良好良好有无水珠产生无有无无无有有有有有有有无无无有无无有无无无有有无有注:“-”表示无可溶性色素产生。菌株编号T1T2T3T4T5T6T7T8T9T10T11T12T13T14T15T16T17气生菌丝浅白灰色微绿黄色浅灰色白灰色灰蓝色灰白色白灰色雪白色灰色灰褐色淡灰色鼠灰色白灰色淡灰色淡灰色乳褐色深灰色基内菌丝浅黄色乳棕色乳褐色淡黄色深蓝色暗微红橙色深蓝色深褐色乳黑色微褐黄色深褐色褐色褐色棕黑色淡黑色乳褐色黑色可溶性色素-橘色-深蓝色-深蓝色-生长状况良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好较差良好有无水珠产生无有无有无无有有有
15、无无无无无无无无注:“-”表示无可溶性色素产生。表1 从T1T17的放线菌菌落特征-104晏爱芬,何寒霞:土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究2.2 抑菌放线菌筛选从蚯蚓口部到沙囊这一段消化道中共分离到抑菌放线菌有12株,而肠道中的抑菌放线菌有3株。对枯草芽孢杆菌抑制作用最好的是菌株C24,对金黄色葡萄球菌抑制作用最好的是菌株C24,对大肠杆菌抑制作用最好的是菌株T5,其中菌株T13对四种指示菌均有一定的抑菌效果,且对白假丝酵母的抑制作用最好。此次实验主要研究放线菌对供试病原真菌的抑菌活性,因此选用菌株T13来做进一步研究(见表3)。表3 15株放线菌对供试病原菌的抑菌活性菌株编号T
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