司美格鲁肽对脑缺血大鼠的治疗作用及机制_张佳丽.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 19 期司美格鲁肽对脑缺血大鼠的治疗作用及机制张佳丽,胡燕,郑晓梅西南医科大学附属医院神经内科,四川泸州646000摘要:目的观察胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂司美格鲁肽对脑缺血大鼠的治疗作用,并探讨其作用机制。方法将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002组,每组18只。模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002组用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,假手术组分离结扎动脉但不插入线栓。司美格鲁肽+LY294002组造模前30 min经侧脑室注射10 L 10 mmol/L PI3K抑制剂LY294002,其
2、余组给予同等剂量生理盐水。司美格鲁肽组及司美格鲁肽+LY294002组造模后即刻经腹腔注射司美格鲁肽溶液(10 nmol/kg),之后隔日空腹经腹腔注射司美格鲁肽溶液(10 nmol/kg),其余组注射等量生理盐水。分别于造模前及造模后1、3、5、7 d测量血糖;用Longa 5分制评分法对各组神经行为进行评价;TTC染色法观察脑梗死情况,计算脑梗死体积;TUNEL染色法检测缺血脑组织细胞凋亡情况;Western blotting法检测缺血脑组织中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT)及凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、
3、cleaved-Caspase-3)表达,并计算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT;用实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织p53 mRNA表达。结果造模前后各组血糖水平比较差异均无统计学意义(P均0.05)。与假手术组比较,模型组神经行为学评分、脑梗死体积比、凋亡细胞百分比及缺血脑组织中Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表达和p53 mRNA表达高(P均0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及Bcl-2蛋白表达低(P均0.05);与模型组比较,司美格鲁肽组神经行为学评分、脑梗死体积比、凋亡细胞百分比及缺血脑组织中Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表
4、达和p53 mRNA表达低(P均0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及Bcl-2蛋白表达高(P均0.05);与司美格鲁肽组比较,司美格鲁肽+LY294002组神经行为学评分、脑梗死体积比、凋亡细胞百分比及缺血脑组织中 Bax、cleaved-Caspase-3 蛋白表达和 p53 mRNA 表达高(P 均0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及Bcl-2蛋白表达低(P均0.05).Compared with the sham-operated group,the model group showed higher neurobehavioral scores,
5、cerebral infarct volume ratio,percentage of apoptotic cells and expression of Bax,cleaved-Caspase-3 protein and p53 mRNA in the ischemic brain tissues(all P0.05),and lower expression levels of p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT and Bcl-2 protein(all P0.05).In comparison with the model group,the smeaglutide group
6、 showed lower neurobehavioral scores,cerebral infarct volume ratio,percentage of apoptotic cells and expression levels of Bax,cleaved-Caspase-3 protein and p53 mRNA in ischemic brain tissue(all P0.05),and higher expression levels of p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT and Bcl-2 protein(all P0.05).Compared with th
7、e semaglutide group,the semaglutide+LY294002 group exhibited higher neurobehavioral scores,cerebral infarct volume ratio,percentage of apoptotic cells and expression levels of Bax,cleaved-Caspase-3 protein and p53 mRNA in the ischemic brain tissues(all P0.05)and lower expression levels of p-PI3K/PI3
8、K,p-AKT/AKT,and Bcl-2 protein(all P0.05).Conclusion Semeglutide improves neurological deficits,inhibits the neuronal apoptosis,and reduces brain tissue damage in cerebral ischemia rats,and the mechanism of action may be related to the activation of the PI3K/AKT pathway.Key words:cerebral ischemia;gl
9、ucagon-like peptide 1 receptor agonist;semaglutide;neural apoptosis;phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B signaling pathway;rats糖尿病是缺血性脑卒中的危险因素之一,因此部分降糖药物可能对缺血性卒中有改善作用。胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂是一种广泛应用的降糖药物。司美格鲁肽作为新型长效GLP-1受体激动剂,在体内的半衰期可长达7 d。2021年4月,司美格鲁肽被批准在国内上市,其除降糖作用外还可减重,作为减肥药物安全、有效1,发生低血糖风险
10、低。研究表明,GLP-1受体激动剂能降低心血管风险,并通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路发挥抗心肌细胞凋亡作用2。此外,研究证实其还能改善神经功能,有望成为神经保护新型药物3。2021年10月2022年8月,本研究建立脑缺血大鼠模型,探讨司美格鲁肽对大鼠的治疗作用及可能的作用机制,为司美格鲁肽的临床研究提供理论依据。1 材料与方法 1.1动物、试剂及仪器雄性SD大鼠72只,8周龄,体质量280330 g,购自湖北省实验动物研究中心,生产许可证号:SCXK(鄂)2020-0018。饲养环境:清洁级,相对湿度40%70%,室温2225,12 h光/暗循环。本动物
11、实验方案由西南医科大学动物管理委员会批准。司美格鲁肽购于诺和诺德(中国)制药有限公司;PI3K抑制剂LY294002购于昀冠(上海)生物科技有限公司;PBS缓冲液、TTC染色液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒均购于武汉阿斯本生物技术有限公司;TUNEL试剂盒购于上海罗氏制药有限公司;PCR扩增仪购于杭州博日科技股份有限公司;荧光定量PCR仪购于美国Life technologies公司。1.2动物分组与模型制备将 72 只大鼠随机分为假手术组、模型组、司美格鲁肽组(司美格鲁肽组)、司美格鲁肽+LY294002 组,每组 18 只。实验过程中
12、如有大鼠死亡,则进行补充。模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002 组均参考既往文献4-5采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型。术前 12 h 禁食不禁饮,腹腔注射 10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠,将其固定、备皮消毒后选取颈部右侧切口,逐层切开,小心暴露右颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA),分离并结扎ECA和CCA的近心端。于两个结扎端之间的 CCA 靠近分叉处剪一小口,将线栓经该口送入 ICA 并进一步到达颅内大脑中动脉起始处。假手术组用同样的方法分离结扎动脉,但不插入线栓。1.3药物干预司美格鲁肽+LY294002组造模前30 min经侧
13、脑室注射10 L 10 mmol/L PI3K抑制剂LY2940026,其余组给予同等剂量生理盐水。司美格鲁肽组及司美格鲁肽+LY294002组造模后即刻经腹腔注射司美格鲁肽溶液(10 nmol/kg),之后隔日空腹经腹腔注射司美格鲁肽溶液(10 nmol/kg),其余组注射等量生理盐水。造模7 d行为学评分评估42山东医药2023 年第 63 卷第 19 期及血糖测定后过量麻醉处死大鼠。1.4观察指标与方法1.4.1血糖检测分别于造模前及造模后1、3、5、7 d晨,采集各组空腹状态尾静脉血,用血糖仪测量血糖。1.4.2神经行为变化评价造模7 d,采用Longa 5分制评分法7对各组神经行为进
14、行评价。04分,完全无症状计0分,意识丧失、死亡计4分。1.4.3脑梗死情况观察造膜7 d后从各组随机取6只大鼠麻醉处死取脑,保持大脑完整。将脑组织冰冻切片,每张厚度 2 mm,切片用 2%的 TTC 溶液37 染色 20 min,然后用4%多聚甲醛固定后拍照记录。用Image-pro plus软件测算脑梗死体积。1.4.4缺血脑组织凋亡细胞检测采用TUNEL染色法。造膜7 d每组另取6只大鼠麻醉处死,取脑组织固定 24 h,脱水、包埋并切片。常规脱蜡后用纯水、PBS 洗涤,配制蛋白酶 K 工作液及破膜液,TUNEL试剂盒内试剂1和试剂2按1 10混合,配制孵育液,避光孵育,PBS清洗。滴加D
15、API染核,室温避光孵育20 min,再次用PBS清洗;封片,200倍显微镜下观察并计数凋亡细胞。1.4.5缺血脑组织PI3K/AKT信号通路蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT)及凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3)表达检测采用 Western blotting法。造膜7 d将每组剩余的6只大鼠麻醉处死,取缺血部位脑组织并等分为2份,取其中1份提取总蛋白并测定蛋白质含量,调整蛋白质浓度后上样,SDS-PAGE电泳、转膜、室温下加入5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h。加入用抗体稀释液稀释好的兔源一抗 GAPDH(1 10 000)、p-PI3K(1 50
16、0)、PI3K(1 2 000)、p-AKT(1 1 000)、AKT(1 2 000)、Bcl-2(1 1 000)、Bax(1 1 000)及cleaved-Caspase-3(1 500)4 过夜。加入稀释好的二抗,在室温孵育后用TBST洗涤。滴加新鲜配制的ECL混合溶液(A B=1 1)到膜的蛋白面侧,暗室中曝光、显影、定影。AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标条带的光密度值。以目标蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值表示目标蛋白相对表达量,并计算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT。1.4.6缺血脑组织p53 mRNA表达检测采用实时荧光定量PCR法。取另外1份缺血脑组织,
17、严格根据试剂盒说明提取总RNA,进行逆转录得到cDNA。将cDNA作为模板进行PCR扩增,扩增条件:95 30 s预变性;95 10 s,58 30 s,72 30 s,40个循环。以 GAPDH 为内参,GAPDH 上游引物 5-AACAGCAACTCCCATTCTTCC-3,下 游 引 物 5-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3,产物长度164 bp;p53上游引物5-CGGCTCCGACTATACCACTATC-3,下游引物5-GCACAAACACGAACCTCAAAG-3,产物长度153 bp。用2-CT法计算p53 mRNA相对表达量。1.5统计学方法采用 SPSS25.
18、0 统计软件和GraphPad Prism9.0 软件。符合正态分布的计量资料以-x s表示,多组比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD法,不同时间点比较采用重复测量的方差分析;非正态分布计量资料以M(P25,P75)表示,比较采用 MannWhitney U 检验。P0.05),造模后各时间点司美格鲁肽组、模型组、司美格鲁肽+LY294002组血糖水平差异均无统计学意义(P均0.05)。见表1。2.2司美格鲁肽对大鼠神经行为学的影响假手术 组、模 型 组、司 美 格 鲁 肽 组、司 美 格 鲁 肽+LY294002 组神经行为学评分分别为 0、4(34)分、2(1.752)分、3(
19、2.753)分。与假手术组比较,模型组神经行为学评分高(P0.05);与模型组比较,司美格鲁肽组神经行为学评分低(P0.05);与司美格鲁肽组比较,司美格鲁肽+LY294002组神经行为学评分高(P0.05)。2.3司美格鲁肽对大鼠脑梗死体积的影响TTC染色结果显示:假手术组均匀红染,其余各组均有一定的白色梗死区域。各组脑梗死体积比比较见表2。2.4司美格鲁肽对缺血脑组织细胞凋亡的影响镜下可见假手术组无神经细胞凋亡,模型组可见大表1各组不同时间血糖水平(mmol/L,-x s)组别假手术组模型组司美格鲁肽组Sema+LY2940024002组n18181818血糖造模前5.54 0.485.3
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