司美格鲁肽对脑缺血大鼠的治疗作用及机制_张佳丽.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 19 期司美格鲁肽对脑缺血大鼠的治疗作用及机制张佳丽，胡燕，郑晓梅西南医科大学附属医院神经内科，四川泸州646000摘要：目的观察胰高血糖素样肽1（GLP-1）受体激动剂司美格鲁肽对脑缺血大鼠的治疗作用，并探讨其作用机制。方法将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002组，每组18只。模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002组用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型，假手术组分离结扎动脉但不插入线栓。司美格鲁肽+LY294002组造模前30 min经侧脑室注射10 L 10 mmol/L PI3K抑制剂LY294002，其余组给予同等剂量生理盐水。司美格鲁肽组及司美格鲁肽+LY294002组造模后即刻经腹腔注射司美格鲁肽溶液（10 nmol/kg），之后隔日空腹经腹腔注射司美格鲁肽溶液（10 nmol/kg），其余组注射等量生理盐水。分别于造模前及造模后1、3、5、7 d测量血糖；用Longa 5分制评分法对各组神经行为进行评价；TTC染色法观察脑梗死情况，计算脑梗死体积；TUNEL染色法检测缺血脑组织细胞凋亡情况；Western blotting法检测缺血脑组织中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT）及凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3）表达，并计算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT；用实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织p53 mRNA表达。结果造模前后各组血糖水平比较差异均无统计学意义（P均0.05）。与假手术组比较，模型组神经行为学评分、脑梗死体积比、凋亡细胞百分比及缺血脑组织中Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表达和p53 mRNA表达高（P均0.05），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及Bcl-2蛋白表达低（P均0.05）；与模型组比较，司美格鲁肽组神经行为学评分、脑梗死体积比、凋亡细胞百分比及缺血脑组织中Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表达和p53 mRNA表达低（P均0.05），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及Bcl-2蛋白表达高（P均0.05）；与司美格鲁肽组比较，司美格鲁肽+LY294002组神经行为学评分、脑梗死体积比、凋亡细胞百分比及缺血脑组织中 Bax、cleaved-Caspase-3 蛋白表达和 p53 mRNA 表达高（P 均0.05），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及Bcl-2蛋白表达低（P均0.05）.Compared with the sham-operated group，the model group showed higher neurobehavioral scores，cerebral infarct volume ratio，percentage of apoptotic cells and expression of Bax，cleaved-Caspase-3 protein and p53 mRNA in the ischemic brain tissues（all P0.05），and lower expression levels of p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT and Bcl-2 protein（all P0.05）.In comparison with the model group，the smeaglutide group showed lower neurobehavioral scores，cerebral infarct volume ratio，percentage of apoptotic cells and expression levels of Bax，cleaved-Caspase-3 protein and p53 mRNA in ischemic brain tissue（all P0.05），and higher expression levels of p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT and Bcl-2 protein（all P0.05）.Compared with the semaglutide group，the semaglutide+LY294002 group exhibited higher neurobehavioral scores，cerebral infarct volume ratio，percentage of apoptotic cells and expression levels of Bax，cleaved-Caspase-3 protein and p53 mRNA in the ischemic brain tissues（all P0.05）and lower expression levels of p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and Bcl-2 protein（all P0.05）.Conclusion Semeglutide improves neurological deficits，inhibits the neuronal apoptosis，and reduces brain tissue damage in cerebral ischemia rats，and the mechanism of action may be related to the activation of the PI3K/AKT pathway.Key words：cerebral ischemia；glucagon-like peptide 1 receptor agonist；semaglutide；neural apoptosis；phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B signaling pathway；rats糖尿病是缺血性脑卒中的危险因素之一，因此部分降糖药物可能对缺血性卒中有改善作用。胰高血糖素样肽1（GLP-1）受体激动剂是一种广泛应用的降糖药物。司美格鲁肽作为新型长效GLP-1受体激动剂，在体内的半衰期可长达7 d。2021年4月，司美格鲁肽被批准在国内上市，其除降糖作用外还可减重，作为减肥药物安全、有效1，发生低血糖风险低。研究表明，GLP-1受体激动剂能降低心血管风险，并通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路发挥抗心肌细胞凋亡作用2。此外，研究证实其还能改善神经功能，有望成为神经保护新型药物3。2021年10月2022年8月，本研究建立脑缺血大鼠模型，探讨司美格鲁肽对大鼠的治疗作用及可能的作用机制，为司美格鲁肽的临床研究提供理论依据。1 材料与方法 1.1动物、试剂及仪器雄性SD大鼠72只，8周龄，体质量280330 g，购自湖北省实验动物研究中心，生产许可证号：SCXK（鄂）2020-0018。饲养环境：清洁级，相对湿度40%70%，室温2225，12 h光/暗循环。本动物实验方案由西南医科大学动物管理委员会批准。司美格鲁肽购于诺和诺德（中国）制药有限公司；PI3K抑制剂LY294002购于昀冠（上海）生物科技有限公司；PBS缓冲液、TTC染色液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒均购于武汉阿斯本生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购于上海罗氏制药有限公司；PCR扩增仪购于杭州博日科技股份有限公司；荧光定量PCR仪购于美国Life technologies公司。1.2动物分组与模型制备将 72 只大鼠随机分为假手术组、模型组、司美格鲁肽组（司美格鲁肽组）、司美格鲁肽+LY294002 组，每组 18 只。实验过程中如有大鼠死亡，则进行补充。模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002 组均参考既往文献4-5采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型。术前 12 h 禁食不禁饮，腹腔注射 10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉大鼠，将其固定、备皮消毒后选取颈部右侧切口，逐层切开，小心暴露右颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA），分离并结扎ECA和CCA的近心端。于两个结扎端之间的 CCA 靠近分叉处剪一小口，将线栓经该口送入 ICA 并进一步到达颅内大脑中动脉起始处。假手术组用同样的方法分离结扎动脉，但不插入线栓。1.3药物干预司美格鲁肽+LY294002组造模前30 min经侧脑室注射10 L 10 mmol/L PI3K抑制剂LY2940026，其余组给予同等剂量生理盐水。司美格鲁肽组及司美格鲁肽+LY294002组造模后即刻经腹腔注射司美格鲁肽溶液（10 nmol/kg），之后隔日空腹经腹腔注射司美格鲁肽溶液（10 nmol/kg），其余组注射等量生理盐水。造模7 d行为学评分评估42山东医药2023 年第 63 卷第 19 期及血糖测定后过量麻醉处死大鼠。1.4观察指标与方法1.4.1血糖检测分别于造模前及造模后1、3、5、7 d晨，采集各组空腹状态尾静脉血，用血糖仪测量血糖。1.4.2神经行为变化评价造模7 d，采用Longa 5分制评分法7对各组神经行为进行评价。04分，完全无症状计0分，意识丧失、死亡计4分。1.4.3脑梗死情况观察造膜7 d后从各组随机取6只大鼠麻醉处死取脑，保持大脑完整。将脑组织冰冻切片，每张厚度 2 mm，切片用 2%的 TTC 溶液37 染色 20 min，然后用4%多聚甲醛固定后拍照记录。用Image-pro plus软件测算脑梗死体积。1.4.4缺血脑组织凋亡细胞检测采用TUNEL染色法。造膜7 d每组另取6只大鼠麻醉处死，取脑组织固定 24 h，脱水、包埋并切片。常规脱蜡后用纯水、PBS 洗涤，配制蛋白酶 K 工作液及破膜液，TUNEL试剂盒内试剂1和试剂2按1 10混合，配制孵育液，避光孵育，PBS清洗。滴加DAPI染核，室温避光孵育20 min，再次用PBS清洗；封片，200倍显微镜下观察并计数凋亡细胞。1.4.5缺血脑组织PI3K/AKT信号通路蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT）及凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3）表达检测采用 Western blotting法。造膜7 d将每组剩余的6只大鼠麻醉处死，取缺血部位脑组织并等分为2份，取其中1份提取总蛋白并测定蛋白质含量，调整蛋白质浓度后上样，SDS-PAGE电泳、转膜、室温下加入5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h。加入用抗体稀释液稀释好的兔源一抗 GAPDH（1 10 000）、p-PI3K（1 500）、PI3K（1 2 000）、p-AKT（1 1 000）、AKT（1 2 000）、Bcl-2（1 1 000）、Bax（1 1 000）及cleaved-Caspase-3（1 500）4 过夜。加入稀释好的二抗，在室温孵育后用TBST洗涤。滴加新鲜配制的ECL混合溶液（A B=1 1）到膜的蛋白面侧，暗室中曝光、显影、定影。AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标条带的光密度值。以目标蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值表示目标蛋白相对表达量，并计算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT。1.4.6缺血脑组织p53 mRNA表达检测采用实时荧光定量PCR法。取另外1份缺血脑组织，严格根据试剂盒说明提取总RNA，进行逆转录得到cDNA。将cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增条件：95 30 s预变性；95 10 s，58 30 s，72 30 s，40个循环。以 GAPDH 为内参，GAPDH 上游引物 5-AACAGCAACTCCCATTCTTCC-3，下 游 引 物 5-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3，产物长度164 bp；p53上游引物5-CGGCTCCGACTATACCACTATC-3，下游引物5-GCACAAACACGAACCTCAAAG-3，产物长度153 bp。用2-CT法计算p53 mRNA相对表达量。1.5统计学方法采用 SPSS25.0 统计软件和GraphPad Prism9.0 软件。符合正态分布的计量资料以-x s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法，不同时间点比较采用重复测量的方差分析；非正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，比较采用 MannWhitney U 检验。P0.05），造模后各时间点司美格鲁肽组、模型组、司美格鲁肽+LY294002组血糖水平差异均无统计学意义（P均0.05）。见表1。2.2司美格鲁肽对大鼠神经行为学的影响假手术 组、模 型 组、司 美 格 鲁 肽 组、司 美 格 鲁 肽+LY294002 组神经行为学评分分别为 0、4（34）分、2（1.752）分、3（2.753）分。与假手术组比较，模型组神经行为学评分高（P0.05）；与模型组比较，司美格鲁肽组神经行为学评分低（P0.05）；与司美格鲁肽组比较，司美格鲁肽+LY294002组神经行为学评分高（P0.05）。2.3司美格鲁肽对大鼠脑梗死体积的影响TTC染色结果显示：假手术组均匀红染，其余各组均有一定的白色梗死区域。各组脑梗死体积比比较见表2。2.4司美格鲁肽对缺血脑组织细胞凋亡的影响镜下可见假手术组无神经细胞凋亡，模型组可见大表1各组不同时间血糖水平（mmol/L，-x s）组别假手术组模型组司美格鲁肽组Sema+LY2940024002组n18181818血糖造模前5.54 0.485.36 0.445.44 0.375.52 0.40造模1 d6.19 0.526.41 0.496.38 0.536.38 0.46造模3 d6.04 0.366.32 0.516.24 0.446.29 0.48造模5 d6.17 0.356.31 0.466.27 0.426.29 0.42造模7 d6.05 0.466.12 0.615.97 0.566.19 0.5643山东医药2023 年第 63 卷第 19 期量凋亡细胞，司美格鲁肽组细胞凋亡较模型组明显减少，司美格鲁肽+LY294002组细胞凋亡较司美格鲁肽组增多。各组脑梗死体积比及凋亡细胞百分比比较见表2。2.5司美格鲁肽对缺血脑组织 PI3K/AKT通路蛋白表达的影响见表3。2.6司美格鲁肽对缺血脑组织凋亡相关蛋白表达的影响见表4。2.7司美格鲁肽对缺血脑组织凋亡相关基因表达的影响假手术组、模型组、司美格鲁肽组、司美格鲁肽+LY294002组缺血脑组织p53 mRNA相对表达量分别为 1.11 0.43、4.06 0.53、2.00 0.74、3.16 0.73。与假手术组比较，模型组缺血脑组织p53 mRNA表达高（P0.05）；与模型组比较，司美格鲁肽组缺血脑组织p53 mRNA表达低（P0.05）；与司美格鲁肽组比较，司美格鲁肽+LY294002组缺血脑组织p53 mRNA表达高（P0.05）。3 讨论 司美格鲁肽是目前唯一一种可口服、可皮下注射的新型长效GLP-1受体激动剂。本研究应用司美格鲁肽7 d后处死大鼠，结果显示，与模型组和司美格鲁肽+LY294002组相比，造模7 d后司美格鲁肽组大鼠神经行为学评分低，提示司美格鲁肽能够减轻脑缺血后大鼠神经功能缺损。司美格鲁肽处理后脑组织白色梗死区域减小，脑梗死体积明显缩小，光镜下缺血区凋亡阳性细胞数明显降低，细胞凋亡明显改善。GLP-1是一种由胃肠道L细胞产生的多肽类激素，它能够与葡萄糖协同作用以提高胰岛细胞的胰岛素分泌从而有效降低血糖水平8。GLP-1受体激动剂对血糖的影响与葡萄糖浓度密切相关，在血糖正常情况下则不会进一步引起低血糖。本实验造模前后血糖水平变化不大，与假手术组相比，司美格鲁肽处理后血糖变化不大，且未引起低血糖，血糖始终维持在正常水平，与既往研究相符。GLP-1受体不仅在胰腺中表达，也表达于心血管、脑、胃肠道、肺、肾、间充质干细胞等。研究证明，GLP-1受体激动剂主要通过与广泛分布在大脑中的GLP-1受体结合发挥作用9。LI等10证实，GLP-1受体激动剂司美格鲁肽能发挥抗心肌缺血、降低心血管发病风险的作用。GLP-1 受体激活可以引起腺苷酸环化酶活化、环磷酸腺苷生成增多、细胞内钙离子增加、蛋白激酶A（PKA）激活，PKA进一步激活PI3K的p85a调节亚基，促使AKT磷酸化，由此对心肌细胞凋亡产生抑制作用11。本研究结果表明，与模型组相比，司美格鲁肽组大鼠脑组织中观察到 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT升高，脑梗死体积减小，神经凋亡细胞数明显减少，证实其在减少神经细胞凋亡中发挥作用；而加用 PI3K 拮抗剂 LY294002后 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT降低。这表明司美格鲁肽可通过PI3K/AKT通路发挥抗凋亡作用，LY294002可抑制司美格鲁肽对PI3K/AKT通路的激活作用并减弱其对神经功能的修复作用。早期缺血半暗带主要发生程序性细胞死亡，即细胞凋亡。脑缺血后产生炎症反应、氧化应激以及线粒体功能障碍等，均能激活细胞凋亡从而导致神经细胞损伤。PI3K/AKT信号通路是经典的抗凋亡途径，与缺血性脑卒中密切相关12-13。PI3K/AKT通路活化可在一定程度上抑制脑缺血后神经细胞凋亡。PI3K活化后可使下游的AKT磷酸化，磷酸化后表2各组脑梗死体积比及凋亡细胞百分比比较（%，-x s）组别假手术组模型组司美格鲁肽组司美格鲁肽+LY294002组n6666梗死体积比0.45 0.2045.30 2.99*21.77 2.18#31.45 3.27凋亡细胞百分比0.35 0.0673.59 5.84*16.61 1.41#24.85 1.36注：与假手术组比较，*P0.05；与模型组比较，#P0.05；与司美格鲁肽组比较，P0.05。表4各组缺血脑组织凋亡相关蛋白表达比较（-x s）组别假手术组模型组司美格鲁肽组司美格鲁肽+LY294002组n6666Bcl-20.62 0.040.15 0.02*0.39 0.03#0.30 0.03Bax0.08 0.021.01 0.06*0.22 0.03#0.52 0.07cleaved-Caspase-30.23 0.060.94 0.15*0.37 0.09#0.70 0.14注：与假手术组比较，*P0.05；与模型组比较，#P0.05；与司美格鲁肽组比较，P0.05。表3各组缺血脑组织PI3K/AKT通路蛋白表达比较（-x s）组别假手术组模型组司美格鲁肽组司美格鲁肽+LY294002组n6666p-PI3K/PI3K0.66 0.050.08 0.03*0.36 0.03#0.18 0.02p-AKT/AKT1.00 0.070.21 0.04*0.66 0.03#0.42 0.05注：与假手术组比较，*P0.05；与模型组比较，#P0.05；与司美格鲁肽组比较，P0.05。44山东医药2023 年第 63 卷第 19 期的AKT能抑制Caspase-9的活性，并抑制下游信号分子如Caspase-3的合成进而抑制细胞凋亡；此外，活化后的AKT还可以通过增加游离Bcl-2、Bcl-xL含量发挥抗凋亡作用。急性脑缺血后Bcl-2家族促凋亡因子的激活导致线粒体被破坏，细胞色素C释放并与相关促凋亡分子结合形成特定的凋亡小体14，激活Caspase-9并与其裂解，进一步激活Caspase-3从而导致DNA损伤和神经元细胞死亡15。Bcl-2蛋白家族是影响线粒体膜功能和结构的主要调控因子，它主要包括抗凋亡作用的蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w以及促凋亡作用的蛋白 Bax、Bak、p53 上调凋亡调节蛋白16。PUMA表达上调，引起p53磷酸化和乙酰化，增强 PUMA 和 Bcl-X 的相互作用，从而介导细胞凋亡17。本研究表明，司美格鲁肽干预后，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，同时抑癌基因p53、cleaved-Caspase-3以及促凋亡蛋白Bax表达降低，凋亡途径被阻断；加PI3K 拮抗剂 LY294002 后司美格鲁肽的作用被抑制，Bcl-2表达下降，p53、Bax以及cleaved-Caspase-3表达升高。进一步表明司美格鲁肽能够通过激活PI3K/AKT信号通路进而激活下级信号分子，从而抑制脑缺血大鼠神经细胞凋亡，减轻神经损伤。综上所述，司美格鲁肽可缩小脑缺血大鼠梗死体积，抑制神经细胞凋亡，其机制可能与PI3K/AKT通路相关。本研究缺乏对PI3K/AKT下游信号分子的检测，结果存在局限性。PI3K抑制剂未完全消除司美格鲁肽的抗凋亡作用，这表明该过程有其他通路参与。此外，司美格鲁肽的抗凋亡作用可能不是其介导保护神经功能的唯一作用，多项研究表明GLP-1受体激动剂也能促血管内皮生成18、介导神经炎症19及氧化应激10。因此促血管内皮生成和抗炎抗氧化机制也可能在脑缺血后司美格鲁肽的神经保护中发挥作用。司美格鲁肽对血管内皮活性、神经炎症反应及氧化应激的影响及机制有待进一步探索。参考文献：1CHRISTOU G A，KATSIKI N，BLUNDELL J，et al.Semaglutide as a promising antiobesity drug J.Obes Rev，2019，20（6）：805-815.2赵立峰，刘英，刘冠英.GLP-1受体激动剂对心血管的保护机制研究进展 J.海峡药学，2021，33（3）：143-145.3MARLET I R，OLMESTIG J，VILSBOLL T，et al.Neuroprotective mechanisms of glucagon-like peptide-1-based therapies in ischaemic stroke：a systematic review based on pre-clinical studies J.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2018，122（6）：559-569.4李洪亮，薛智慧，龙抗胜，等.线栓法制备MCAO模型大鼠的经验体会 J.中国中医急症，2014，23（12）：2216-2219.5LONGA E Z，WEINSTEIN P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 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