芍药红斑病病原菌鉴定、生物学特性及有效药剂筛选.pdf
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1、红斑病是芍药栽培中的严重病害之一,病原菌复杂。为明确运城市芍药红斑病的病原,本研究采集舜帝公园具有红斑病症状的芍药叶片和茎秆,分离病原菌,并结合形态学特征和3种基因序列(核糖体内转录间隔区rDNA-ITS、真核延伸因子TEF-1、RNA 聚合酶II第二大亚基RPB2)联合分析进行病原鉴定。结果表明,运城市芍药红斑病原为链格孢(Alternariaalternata)和细极链格孢(A.tenuissima)。生物学特性分析结果表明,该病原菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)上菌落生长旺盛、菌丝粗壮,菌丝生长最适温度为2 5 30,最适pH值为7 8,病原菌生长的最
2、佳碳源为麦芽糖和可溶性淀粉,最佳氮源为NaNO,、蛋白。室内毒力测定结果发现,7 种杀菌剂对病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中2 5%吡唑醚菌酯、50%咯菌对病原菌菌丝生长的抑制作用较强,两种杀菌剂抑制中浓度(ECso)均小于1.0 mgL-l。该研究结果可为山西省芍药红斑病的精准防控提供理论依据。关键词:芍药;红斑病;病原鉴定;毒力测定D0I:10.11869/j.issn.1000-8551.2023.08.1533芍药(PaeonialactifloraPall.)是中国的传统名花,品种多、花色丰富、花型多变,被誉为“五月花神”,具有很高的观赏价值1。芍药适应性强,能露地越冬,各
3、地园林普遍栽培。近年来,因其花期稍长,花色丰富,已成为深受大众喜爱的切花材料,在国内外都有广阔的市场2 。另外,芍药肉质根是常用的中药材3-4。近年来,随着芍药种植面积的扩大和种植品种的增多,病害发生逐年增多,危害越来越重。苟药红斑病,又称黑斑病、褐斑病,是一种严重危害芍药叶片、枝干的真菌病害。植株发病后,叶片及枝干上出现不规则红褐色病斑,导致植株光合能力下降,严重影响芍药长势及观赏价值5-6 目前已有很多关于芍药病害病原调查的研究,病害的防治大多采用筛选抗性品种、加强管理等农业措施7-9。不同病原物可能引起相似的症状,某种植物病害在不同生态条件、不同地域也可能存在病原菌的差异。关于芍药红斑病
4、病原方面的研究,前人报道的病原包括枝孢属(Cladosporium paeoniae)7、二岐枝孢(Dichocladosporium chlorocephalum)5、链格孢(Alternariaalternata)9等侵染,以及链格孢(A.alternata)和细极链格孢(A.tenuissima)复合侵染10 ,可见不同地域不同生态条件下,芍药红斑病病原菌差异较大。明确当地红斑病病原菌并筛选杀菌效果良好的药剂,对于芍药红斑病的科学防治具有重要意义。因此,本研究以山西省运城市舜帝公园发病苟药为研究对象,从病株上分离纯化病原物,根据病原菌的形态学特征,并利用病原菌多基因,即核糖体基因转录间隔
5、区(rDNA-internal transcribed spacer,rDNA-ITS)、真核延伸因子(translation elongation factors l,T EF-l)以及RNA聚合酶II第二大亚基(the second largest RNApolymerase subunit,RPB2)基因序列构建系统发育树,确定病原菌分类地位,明确病原菌适宜培养基、最适碳源、氮源等生长条件,同时对7 种常用杀菌剂进行毒力测定,筛选该病害防治的有效药剂,以期为运城市芍药红斑病的有效防控提供理论基础。1材料与方法1.1发病样品采集2020年5月至2 0 2 2 年的8 月在运城市舜帝公园芍收
6、稿日期:2 0 2 2-10-2 0 接受日期:2 0 2 2-12-2 7基金项目:山西省基础研究计划(2 0 2 10 30 2 12 30 8 4),运城市科技计划项目(YCKJ-2021029),山西省特色农产品发展学科群科研项目(SKX-2022012)作者简介:李培谦,男,副教授,主要从事真菌病害研究。E-mail:*通讯作者:冯宝珍,女,教授,主要从事真菌病害研究。E-mail:f e n g b a o z h e n 12 6.c o m153437卷报农学核药种植园里选取疑似芍药红斑病的植株。记录其发病症状、发病部位,拍照后采集发病样品,用无菌自封袋封装并带回实验室,置于4
7、冰箱中保存待用1.2分离纯化病原菌利用组织分离法分离病原菌11。将采集的芍药发病组织用清水冲洗并晾干,在病健交界处剪取病变组织,发病叶片和发病茎段约5mmx5mm大小,先用7 5%酒精消毒1min,再用0.1%的升汞消毒2 min,无菌水冲洗3遍,置于滤纸上吸干表面水分,接种于马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PD A)平板上,25恒温培养5 7 d,待病样组织周围长出菌落后,采用单孢分离法对病原菌进行纯化12 ,至菌落形体一致。纯化后,切取带有培养基的菌丝条,装人含有少许无菌水的2 mL冻存管,于4冰箱保存。1.3分离菌株的致病性测定根据柯赫氏法则,采集大富贵芍药健康幼
8、嫩茎叶,采用离体接种法进行致病性测定13-141。首先配制新鲜病原菌孢子悬浮液,调节浓度至110 个mL-备用。先用无菌水冲洗再用7 5%酒精对芍药健康幼嫩茎叶表面消毒,在叶片或茎秆组织上用无菌注射器制造微创伤口,然后将2 0 L孢子悬液滴在伤口处,以无菌水为空白对照。然后将接种组织置于铺有湿润滤纸的无菌培养皿中,2 5恒温培养,每隔2 4h观察记录组织发病情况,待发病后重新分离病原菌并检验形态特征是否与接种病原一致1.4分离菌株的形态学鉴定从纯化后的菌落边缘挑取少许病原菌菌丝,接种在PDA平板上,2 5恒温培养5 7 d,每天观察菌落生长快慢、大小、颜色等特征。待菌丝产孢后,挑取少量菌丝制作
9、装片,在显微镜下观察分生孢子和分孢梗形态特征,对孢子形状、颜色、纵横隔膜等形态特征进行记录,测量孢子大小,参考文献15-16 的方法确定病原菌种类。1.5分离菌株的分子生物学鉴定将分离菌株菌丝块接种于液体马铃薯葡萄糖培养液(potatodextrose broth,PDB),2 5、150 r mi n*条件下震荡培养5d后收集菌丝,根据基因组DNA提取试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。分子鉴定所用引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据文献17 所述的方法扩增目的基因片段并测序,将获得的ITS、T EF-1和RPB2基因序列在NCBI数据库(https
10、:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg))进行BLAST比对分析,并上传至GenBank数据库(https:/submit.ncbi.nlm.nih.gov/about/genbank)。下载GenBank中链格孢属参考菌株的相应序列,并使用BioEdit7.0.9.0软件18 将各菌株的3个基因序列进行整合。经过软件CLUSTALX1.83进行多重序列比对19,利用MEGA-X采用邻接法(neighbor-joining methods,NJ)对整合序列构建系统发生树,设置1000次循环检验2 0),选择囊状匍柄霉(Stemphyliumvesicarium)作为
11、外群,根据分离菌株与已知菌株的亲缘关系确定其分类地位17.2 1 表1分子鉴定所用引物Table1Primers for molecular identification引物名称引物序列(5-3)文献Primer namePrimer sequence(53)ReferenceITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG17ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCEF1-728CATCGAGAAGTTCGAGAAGG17EF1-986RTACTTGAAGGAACCCTTACCRPB2-5F2GGGGWGAYCAGAAGAAGGC21RPB2-7cRCCCATRGCTTGTYYRC
12、CCAT1.6生物学特性测定1.6.1不同培养基对病原菌菌落生长影响参照文献2 2-2 3 中对病原菌生物学特性的研究方法,将制备好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA、马铃薯蔗糖琼脂培养基(potato sucroseagar,PSA)、马铃薯胡萝卜琼脂培养基(potato and carrot agar,PCA)、燕麦培养基(o a t me a l a g a r,O A)、查氏培养基(Czapeks)、淀粉琼脂培养基(starchagar,SA)、葡萄糖蛋白陈琼脂培养基(glucose peptone agar,CPA)、麦芽糖琼脂培养基(maltoseagar,M A)、酵母浸膏琼脂培养基
13、(yeastextractagar,YEA)融化后倒在9cm培养皿中制成平板。在已活化的病原菌平板边缘用打孔器打取5mm菌饼,每平板中央接种一个菌饼,3个重复,2 5培养7 d后,观察病原菌在不同培养基上菌落形态并用十字交叉法测量菌落直径。1.6.2不不同碳源、氮源对病原菌菌落生长影响尚以查氏培养基为基础培养基和对照9,查氏培养基中的蔗糖分别以等质量的可溶性淀粉、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖代替。以硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、氯化铵、蛋白陈、牛肉浸膏等质量替换查氏培养基中的NaNO,配制成不同氮源培养基。铺制平板并接种病原菌,按照1.6.1中的方法分析不同碳源、氮源对菌丝生长的影响。1.6.
14、3温度条件对病原菌菌落生长的影响按照1.6.1的方法打取菌饼并接种在PDA平板上,温度处理分别设置为5、10、15、2 0、2 5、30、35、40,每个处理15358期芍药红斑病病原菌鉴定、生物学特性及有效药剂筛选3个重复。连续培养7 d后,用十字交叉法测量菌落直径2 4。1.6.4不同pH值对病原菌菌落生长的影响用1molL-的HCL和NaOH分别将PDA培养基调节其pH值至4、5、6、7、8、9、10、11,铺制平板,接种病原菌,每处理重复3皿,2 5连续培养7 d后按照1.6.1的方法测量菌落直径分析不同pH值对菌落生长的影响2 。O1.7不同浓度杀菌剂对病原菌的室内毒力测定1.7.1
15、含药平板的制备选择7 种目前常用于防治链格孢病害的化学药剂,将供试药剂按照表2 浓度稀释备用。无菌条件下,分别取0.5mL各浓度的农药加人49.5mL冷却至6 0 左右的PDA培养基中,最终稀释倍数如表2 所示,混匀后倒人4个培养皿制成含药平板,以不加农药的PDA平板作为对照2 2 表2 供供试药剂及其稀释倍数Table2Different fungicides and their dilution multiple供试药剂剂型稀释倍数生产单位FungicideDosage formDilution timesManufacturer10%苯醚甲环唑水分散粒剂1000、2 0 0 0、30 0
16、 0、40 0 0、50 0 0东莞市瑞德丰生物科技有限公司10%difenoconazole25%吡唑醚菌酯乳油1000、2 0 0 0、30 0 0、40 0 0、50 0 0江苏辉丰农化股份有限公司25%pyraclostrobin75%百菌清可湿性粉剂200、40 0、8 0 0、16 0 0、32 0 0陕西汤普森生物保护有限公司75%chlorothalonil80%代森锰锌可湿性粉剂200、40 0、8 0 0、16 0 0、32 0 0南京利民化工有限责任公司80%mncozeb50%异菌脲可湿性粉剂250、50 0、10 0 0、2 0 0 0、40 0 0江西禾益化工有限公
17、司50%iprodione30%戊唑醇可湿性粉剂200、40 0、8 0 0、16 0 0、32 0 0上海亚森特有限责任公司30%tebuconazole50%咯菌睛可湿性粉剂250、50 0、10 0 0、2 0 0 0、40 0 0瑞士先正达作物保护有限公司50%fludioxonil1.7.2不同药剂对病原菌菌丝生长的毒力测定用直径为5mm的打孔器从活化的病原菌平板边缘打取菌饼,将其贴在各含药PDA平板中央,各供试药剂及浓度见表2,以加无菌水为空白对照,每处理4次重复。25恒温培养,待7 d后,对照组菌落基本长满平板,按照1.6.1的方法测量不同药剂浓度平板上的菌落直径,参考前人的方法
18、计算各药剂处理对菌丝生长抑制率和独立回归方程、抑制中浓度(ECs。)和相关系数18.51.8数据分析试验数据采用Excel2010软件进行统计分析,并利用Duncan氏新复极差法进行多重比较。2结果与分析2.1病害症状2020一2 0 2 2 年,连续两年在运城市舜帝公园和运城学院芍药种植园调查发现,每年6 一8 月,芍药红斑病发生严重,危害叶片、茎秆,发病率达50%以上。发病初期,叶片、茎秆上出现黄绿色小点,随后逐渐扩大至圆形或不规则形病斑,可连片生长,病斑一般发生在叶脉两侧或叶片边缘,病斑中心呈黄褐色透明状(图1-a),后期病斑中间成焦枯状,严重时整个叶片焦aSY-1tnCtrlSY-6S
19、Y-6CtSYSY-6de注:a:大田叶片发病症状;b:大田茎秆发病症状;c:人工接种菌株SY-1后3d的叶片症状;d:人工接种菌株SY-6后3d的叶片症状;e:人工接种菌株后3d的茎秆症状;Ctrl:无菌水接种对照Note:a:Natural symptoms on leaves.b:Natural symptoms on stems.c:Leaf symptoms at 3 days post-inoculation with conidia suspension ofthe isolate SY-1.d:Leaf symptoms at 3 days post-inoculation w
20、ithconidia suspension of the isolate SY-6.e:Stem symptoms at 3 dayspost-inoculation with conidia suspension.Ctrl:Control with sterile water.图1芍药红斑病的症状Fig.1Symptoms of peonyred spot disease153637卷报核农学枯死亡。受害茎秆初期出现紫红色的(长)圆形小点,随后病斑逐渐扩展,直至相连成片,病斑长轴扩展至13cm,略有凹陷(图1-b),最后整株凋萎。2.2病原菌分离及致病性测定从发病组织病健交界处随机分离病原,
21、经形态初筛主要分离到两种疑似病原菌,分别选取代表性菌株SY-1、SY-6 制备孢子悬浮液对苟药健康叶片和茎秆进行室内接种试验。结果表明,2 d后叶片接种处开始出现直径约3mm黑色圆形病斑,5d后,病斑直径扩展至8 10 mm,病斑中央出现坏死状;茎秆病斑处呈暗褐色,略有凹陷,周围有暗紫色扩展晕圈,而接种无菌水对照组叶片和茎秆上未见病斑出现。两病原菌接种后的叶片、茎秆发病症状与田间发病症状相同(图1-ce)。从发病组织上重新分离得到与接种病原菌一致的病原物,因此,确定病原物SY-1和SY-6均为芍药红斑病的致病菌。2.3病原菌鉴定2.3.1形态学特征从发病芍药组织上分离到病原真菌12 株,经纯化
22、和单孢培养,得到两种疑似病原菌,选取代表菌株SY-1、SY-6,于PDA平板上2 5培养培养1 2 d,菌丝呈白色绒毛状,气生菌丝发达致密,3d后,SY-6菌落转为灰色至灰黑色、墨绿色,背面黑褐色,菌落隆起呈不规则圆形(图2-a);SY-1菌落初期白色,3d后转为灰色、灰绿色,菌丝较短,菌落辐射状生长,无明显隆起,边缘颜色略浅,菌落背面灰黑色(图2-b)。显微镜下,SY-1分生孢子倒棒状、狭长卵形或长椭圆形,浅褐色,约(6.5 7.8)mx(2 8.5 35.6)m,具纵横隔膜,有细长柱状喙或假喙(图2-d)。SY-6 分生孢子梗暗色直立,分枝或不分枝、长短不一,分生孢子深褐色,有深色纵横隔膜
23、,分隔处大多具有缢缩现象,呈椭圆形、卵圆形、倒梨形,孢子大小为(6.3 9.6)mx(9.521.6)m,短喙为浅褐色柱状或锥状(图2-c)。综合菌落特征和分生孢子形态,参照真菌鉴定手册15 及中国真菌志2 6 初步鉴定SY-6为链格孢(Alternariaalternata),SY-1为细极链格孢(A.tenuissima)。2.3.2多基因序列联合分析斤以病原菌SY-1和SY-6的基因组DNA为模板,分别用引物对ITS1/ITS4、EF1-728/EF1-986R、RPB2-5F2/RPB2-7 c R进行PCR扩增并测序。菌株SY-1的ITS、T EF-1、RPB2 的序列长度分别为57
24、 3、2 8 0、98 0 bp,测序结果提交至GenBank(ITS为OP962320,TEF-1为OP980552,RPB2为OP980553);SY-6的ITS、T EF-1、RPB2 的序列长度分别为57 2、2 8 2、97 8 bp,测序结果提交至GenBank(IT S为0 P962321,TEF-1为0 P980554,RPB2为0 P980555);aD20um20m注:a:SY-6在PDA上菌落形态;b:SY-1在PDA上菌落形态;c:SY-6的分生孢子;d:SY-1的分生孢子。Note:a:Morphological characteristics of strain S
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