三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性.pdf

文章编号：1006-3080(2023)04-0515-14DOI:10.14135/ki.1006-3080.20220223001三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性周倍，刘楠，刘泽波，庄英萍，王泽建，郭美锦（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237）摘要：利用三七(Panax notoginseng)悬浮细胞生物合成绿原酸类物质(CGAs)，并对其生物活性进行了研究。对三七细胞中 CGAs 进行定性分析，优化了细胞培养条件以及 6 种诱导模式，测定了三七细胞 CGAs 的抗氧化及-葡萄糖苷酶活性抑制能力。结果表明三七愈伤组织内含有 4 种 CGAs；最优工艺条件为：B5+40g/L 蔗糖，pH7.5，15%接种量；经 30mol/L茉莉酸甲酯诱导 3d 后，CGAs 产量(684.07mg/L)比原工艺(475.18mg/L)提高了 0.44 倍；三七细胞 CGAs 具有良好的抗氧化及-葡萄糖苷酶活性抑制能力。关键词：三七愈伤组织细胞；悬浮培养；绿原酸生物合成；工艺优化；生物活性中图分类号：TS201.3文献标志码：A三七（Panax notoginseng，PN）是五加科人参属植物，为我国传统的珍贵药食同源中药材1。三七含有皂苷、酚酸、黄酮、多糖类等活性成分，具有散瘀止血、消肿定痛等功效2。目前，三七药材资源主要依赖人工种植，且易受栽培环境影响，因而限制了其进一步开发与应用。植物细胞培养技术是一种可替代人工种植生产三七药材的手段。目前，国内外三七细胞培养的研究主要集中在三七皂苷的生物合成3，对三七细胞中其他活性组分的研究较少。绿原酸类物质(CGAs)是三七药材中的一类生物活性成分，具有抗氧化、体外降血糖、抗炎、抗病毒以及抑菌等多种生物活性功能4-5。因此，CGAs 可作为护色、增香及天然防腐剂应用于食品行业。三七具有多种药理活性，其中抗氧化活性是其重要功能，但三七中具体组分对抗氧化活性的贡献尚不明确。传统活性化合物的分离、纯化和功效评价等筛选过程的实验周期长，人力成本高6。近年来，随着化学计量学方法的发展，利用偏最小二乘分析法(PLS)等分析方法可快速高效地预测中药色谱指纹图谱与活性功能之间的谱效关系，已被应用于中药有效组分的筛选及中药的质量评估7。Liu 等8利用 PLS 分析了罗汉果细胞提取物中 15 种多酚组分与其抗氧化能力之间的效应关系，结果表明 15 种多酚组分与罗汉果细胞提取物的抗氧化能力呈正相关关系，且其中 3 种多酚可能起关键作用。本文通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，分离与鉴定了三七愈伤组织中的CGAs；优化了三七细胞悬浮培养的培养基体系，选取了茉莉酸甲酯、水杨酸、酵母提取物、褪黑素、黑曲霉、脱氮假单胞菌等诱导子，进一步提高了三七悬浮细胞生物合成 CGAs 能力；对三七细胞 CGAs 抗氧化及-葡萄糖苷酶抑制活性进行了探究。本文建立了一个较为高效的生物合成 CGAs 的三七细胞悬浮培养体系，拓展了三七植物资源，为三七细胞在食品及日化领域的应用奠定了基础。1实验部分 1.1 原料与试剂三七愈伤组织、黑曲霉、脱氮假单胞菌均保藏于华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室。收稿日期：2022-02-23基金项目：国家重点研发计划(2020YFA0906800)作者简介：周倍(1996)，女，浙江省诸暨人，硕士生，研究方向为植物细胞培养与代谢工程。E-mail：通信联系人：郭美锦，E-mail:guo_引用本文：周倍,刘楠,刘泽波,等.三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性 J.华东理工大学学报（自然科学版）,2023,49(4):515-528.Citation：ZHOUBei,LIUNan,LIUZebo,et al.BiosynthesisandBioactivityofChlorogenicAcidsinPanax notoginsengSuspensionCellsJ.JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology,2023,49(4):515-528.Vol.49No.4华东理工大学学报（自然科学版）2023-08JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology515B5、1/2B5、MS、1/2MS 培养基：分析纯，青岛海博生物技术有限公司；蔗糖：分析纯，上海泰坦科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1-萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6-BA)、阿卡波糖：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；茉莉酸甲酯：分析纯，上海 MERYER 公司；水杨酸：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；褪黑素、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、绿原酸(3-O-咖啡酰奎宁酸，纯度98%)、对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；4,5-O-二咖啡酰奎宁酸(纯度98%)：上海玉函化工有限公司；酵母提取物：分析纯，美国 ThermoFisherScientific 公司；-葡萄糖苷酶(来源于酵母)：上海新铂化学技术有限公司；乙腈、甲醇：色谱纯，美国 Tedia 公司；其他分离提纯用有机溶剂为分析纯。1.2 测试与表征Y15 全自动分析仪(西班牙 Biosystem 公司)；*Q-Exactiveplus 高分辨液质联用仪、VarioskanLUX多功能酶标仪(美国 ThermoFisherScientific 公司)；Agilent1260 安 捷 伦 液 相 色 谱 仪(美 国 AgilentTechnologies 公 司)；FiveEasyPlus 台 式 电 导 率 仪、FiveEasyPlus台式 pH 计(美国 Mettler-Toledo 公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；超声波清洗机(苏州创惠电子有限公司)。1.3 实验步骤1.3.1三七愈伤组织 CGAs 结构分析（1）样品的制备准确称取 0.1g 烘干至恒重的三七愈伤组织，加 2mL、=70%的甲醇溶液，超声 50min，随后以4000r/min 离心 10min，收集上清，用 0.22m 有机相滤膜过滤，制得待测样品溶液。（2）HPLC 检测条件流动相：磷酸(=0.05%)(A)及乙腈(B)；流速：1.0mL/min；色谱柱：UnitaryC18 柱(4.6mm250mm，5m)；柱温：40；检测波长：327nm；进样量：10L；洗脱条件：035min，5%31.6%（体积分数，下同）乙腈；3537min，31.6%80%乙 腈；3738min，80%5%乙腈；3845min，5%5%乙腈。（3）UPLC-MS/MS 检测质条件电喷雾离子源(ESI)：负离子扫描模式；质荷比（m/z）范围：3001000；扫描速率：13000Da/s；雾化器压力：0.345MPa；锥孔电压：40V。（4）总 CGAs 产量测定总 CGAs 产量以绿原酸含量计，准确称取 20mg绿原酸标品用甲醇定容至 100mL，配制成 200mg/L的母液，将母液稀释至不同浓度，分别测定其在327nm 处的吸光度，制作绿原酸浓度与吸光度标准曲线。将待测样品稀释至适当倍数，测定其在 327nm处的吸光度，随后计算待测样品中 CGAs 产量。1.3.2三七细胞悬浮培养体系的建立及其培养条件的优化（1）三七细胞悬浮培养体系的建立选择质地疏松、颜色呈淡黄色的胚性愈伤组织，按 10%的接种量接入液体培养基中，隔 10d 进行一次继代培养，继代 2 次过 10 目（1700m）筛 1 次(去除大颗粒细胞)，初步建立悬浮培养体系。三七悬浮细胞初始培养基配方：B5、4.0mg/LNAA、0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、2g/LPVP，初始 pH 为 6.0，接种量 10%。（2）不同培养条件对三七悬浮细胞生物量及CGAs 影响本文从接种量、培养基类型、碳源种类及浓度、pH 等方面优化三七细胞悬浮培养基体系，优化方案如下：接种量分别为 5%、10%、15%、20%、25%、30%；基础培养基为 1/2B5、B5、1/2MS、MS、N6；碳源种类分别为葡萄糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、海藻糖；碳源质量浓度分别为 10、20、30、40、50、60g/L；pH 分别为 3.0、4.5、6.0、7.5、9.0。在 150mL 的摇瓶中装 40mL 液体培养基，将三七细胞接入摇瓶中，每个处理组设 3 组平行。在转速为 115r/min 的摇床上，25 恒温培养 6d 后收获细胞，放入 60 烘箱烘干至恒重，记录细胞质量并计算 CGAs 产量。（3）优化前后三七细胞悬浮培养参数测定将三七细胞分别接种于优化前后的培养基中，每天取样(3 组平行)，测定培养基中细胞干重、CGAs产量、总糖含量、还原糖含量、氨态氮含量、电导率、细胞活力及 pH 变化。在 Origin 软件(version2018)中分别利用 Logistic 方程和 Luedeking-Piret 方程9对三七悬浮细胞生长及 CGAs 产物合成曲线进行拟合，得到其动力学方程。Logistic 方程：Xt=X0emt1(X0Xm)(1emt)式中：m为最大细胞比生长速率(d1)，Xm为最大生物量(g/L)，X0为初始生物量(g/L)，t 为培养时间(d)。Luedeking-Piret 方程：516华东理工大学学报（自然科学版）第49卷Pt=P0+(XtX0)+Xmmln1(X0Xm)(1emt)式中：、为生长相关和非生长相关参数，Pt为产量(mg/L)，P0为初始产量(mg/L)。1.3.3诱导子筛选及其诱导 CGAs 生物合成添加量的优化（1）诱导子的制备茉莉酸甲酯诱导子(MeJA)制备方法：吸取 235L茉莉酸甲酯用无水乙醇定容至 100mL，0.22m 有机相滤膜过滤制成 10mmol/L 母液备用。水杨酸诱导子(SA)制备方法：准确称取 0.138g水杨酸粉末，加无水乙醇定容至 10mL，0.22m 有机相滤膜过滤制成 100mmol/L 母液备用。黑曲霉诱导子(ANE)及脱氮假单胞菌诱导子(PDE)制备方法：参照 Li 等10的方法，制成母液备用，诱导子母液浓度以多糖含量计，以葡萄糖为标准，利用苯酚硫酸比色法测定。酵母提取物诱导子(YE)的制备方法：准确称取0.5g 酵母提取物粉末，加水定容至 5mL，0.22m 水相滤膜过滤制成 100g/L 母液备用。褪黑素诱导子(MT)的制备方法：准确称取0.232g 褪黑素粉末，加无水乙醇定容至100mL，0.22m有机相滤膜过滤制成 10mmol/L 母液备用。（2）诱导子添加量优化三七悬浮细胞按照上一阶段优化方案进行培养，根据生物量变化曲线选定培养第 6d 添加不同浓度的诱导子，共培养 3d 后收集细胞。MeJA 终浓度：0、10、20、30、40、50 mol/L；SA 终 浓 度：0、50、100、200、300、400mol/L；ANE 终质量浓度：0、5、15、25、40、50mg/L；PDE 终质量浓度：0、25、50、125、187.5、250mg/L；YE：0、0.1、0.25、0.5、0.75、1g/L；MT：0、10、25、50、75、100mol/L；每个处理组设置 3 个平行，测定其细胞干重及 CGAs 产量。（3）三七细胞 CGAs 抗氧化能力的测定按 1.3.1 节方法制得最优诱导子诱导前后三七细胞 CGAs，测定其 ABTS、DPPH 自由基清除能力以及还原 Fe3+能力11。实验均以维生素 C(Vc)作为阳性对照，各组均重复 3 次，取平均值计算清除率以及Fe3+还原率，在 Origin 软件中拟合得到不同浓度三七细胞 CGAs 与 ABTS、DPPH 自由基清除率及 Fe3+还原能力的函数，计算 ABTS 以及 DPPH 的自由基清除率（IC50）。（4）三七细胞 CGAs 组分与其抗氧化活性的谱效关系分析随 机 取 6 个 不 同 批 次 的 三 七 细 胞 样 品，在Chromatographic Fingerprint of Traditional ChineseMedicine 软件中(version2004A)对其液相色谱图进行相似度分析。与分离条件(OSP)下建立的色谱图进行比对，得到相似度评分，验证每批各个色谱峰是否分离良好(相似值越大，与 OSP 分离条件下图谱相似度越高)。测定上述不同批次细胞提取物稀释适当倍数后的 ABTS 及 DPPH 自由基清除率，随后在SIMCA 软件(version14.1demo)中采用 PLS 法预测三七悬浮细胞提取物中 CGAs 组分(色谱峰面积)与其抗氧化能力之间的谱效关系7,12。（5）三七细胞 CGAs 抑制-葡萄糖苷酶活性研究按 1.3.1 节制得三七细胞 CGAs，测定其对-葡萄糖苷酶的抑制活性13。PNPG 在-葡萄糖苷酶催化下会生成 4-硝基苯酚(PNP)，在 405nm 处有强吸收。三七细胞 CGAs 抑制酶的活性，减少 PNP 的生成，从而降低吸光度，因此，反应体系在 405nm 处吸光度的变化可间接反应酶抑制率。实验以阿卡波糖作为阳性对照，各组均重复 3 次，取平均值计算抑制率，在 Origin 软件中拟合得到不同浓度三七细胞 CGAs与-葡萄糖苷酶抑制率的函数，计算其 IC50。因三七细胞提取物中部分 CGAs 缺少标准品，因此选取与三七细胞提取物中 CGAs 具有相同母环结构的 3-O-咖啡酰奎宁酸及 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸标准品进行复配，测定其对-葡萄糖苷酶的抑制活性。（6）三七细胞 CGAs 对-葡萄糖苷酶活性抑制类型分析在 80L 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 为 6.8)中加入 20L 不同质量浓度（0、2.0、2.5g/L）的三七细胞 CGAs 和 20L的 1U/mL-葡萄糖苷酶溶液，混匀，在 37 下反应 10min。加入 20L 不同质量浓度(1、2.5、5、7.5、10g/L)的PNPG 溶液，测定其每分钟在 405nm 处的吸光度。根据式（1）可以判断抑制类型：1v=1vmax+Kmvmax1c(1)其中：v 为反应速率，vmax为最大反应速率，Km为米氏常数，c 为底物浓度。1.4 数据分析数据统计分析采用 SPSS，统计学方法使用Duncans 新复极差法检验(p0.05)，每组设置 3 个平行样本。2结果与分析 2.1 三七愈伤组织中 CGAs 分析三七愈伤组织提取物在 327nm 下 HPLC 分离图如图 1(a)所示，各色谱峰之间分离度良好，峰型对第4期周倍，等：三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性517称，其中，峰 3 为最主要组分。随后利用 UPLC-MS/MS对 4 个峰(峰 14)进行了定性分析。14 号峰对应物质的准分子离子峰质荷比(m/z)分别为：353、353、677、515，其二级质谱图含有一个或多个相同的碎片离子峰(m/z 分别为 135、173、179、191、353 等)。此前有研究报道14，上述碎片离子可作为 CGAs(即咖啡酰奎宁酸及其衍生物)的诊断离子(图 2)。其中，峰 1 及峰 2 准分子离子峰 m/z 为 353，因此其可能为单咖啡酰奎宁酸。通常在负离子模式下，3-O-咖啡酰奎宁酸二级碎片中 m/z 为 191 的碎片峰(即奎宁酸残基)占绝对优势15，因此，峰 2(图 1(c)可能为 3-O-咖啡酰奎宁酸。峰 1(图 1(b)二级碎片中除 m/z 为191 碎片离子外，还有 m/z 为 179、135 等碎片离子，将其相对丰度与公开数据进行比对，推测其可能为5-O-咖啡酰奎宁酸15。此外，峰 3 及峰 4(图 1(d)、1(e)除含有与峰 1、峰 2 类似的碎片离子外，还具有m/z 为 515 的碎片离子峰。因此其结构中可能含有二咖啡酰奎宁酸骨架16。将峰 4 诊断峰相对丰度与文献 15 进行比对，推测其可能为 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸。峰 3 与峰 4 诊断峰相对丰度一致，且准分子离子峰相差 162，推测其可能为三咖啡酰奎宁酸或 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷衍生物16。根据 Zhang 等17发现，三咖啡酰奎宁酸出峰时间晚于 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，但峰 3 出峰时间早于峰 4，因此，峰 3 可能为4,5-二咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷衍生物，其结构式如图 1(d)所示，此物质在三七植物细胞中为首次发现。随后经标品对比(图 1(a)，确认峰 1、2、4 分别为 3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸以及 4,5-O-二咖啡酰奎宁酸。2.2 三七悬浮细胞培养条件的优化2.2.1三七细胞悬浮培养体系的建立挑选生长旺盛、质地疏松、颜色呈淡黄色的胚性三七愈伤细胞(图 3(a)接入液体培养基中，经过多次继代及筛分处理，得到密度大、颗粒大小均一、不易褐化的三七悬浮细胞(图 3(b)，初步建立了三七细胞悬浮培养体系。2.2.2不 同 培 养 条 件 对 三 七 悬 浮 细 胞 生 物 量 及CGAs 产量影响接种量对三七细胞悬浮培养的影响结果如图 4(a)所示。当接种量为 15%时，三七悬浮细胞生物量增殖倍数最高，且 CGAs 产量也最高。在 5 种常用的植物细胞培养基中(图 4(b)，1/2B5、B5 培养基均适合三七悬浮细胞生长，生物量分别为7.39g/L 和7.62g/L；但在CGAs 产量上，B5 培养基更能促进三七悬浮细胞生物合成 CGAs(产量 92.27mg/L)，因此，选用 B5 培养基作为最佳液体培养基。碳源对植物细胞生长来说是不可或缺的，选择适宜的碳源及合适的浓度是优化培养基体系中关键的一步18。如图 4(c)所示，在碳源质量浓度均为 20g/L时，蔗糖作为碳源时三七悬浮细胞生长最好(细胞生物量 7.27g/L)，其次为甘露糖、海藻糖和葡萄糖；且蔗糖、海藻糖作为碳源时，CGAs 产量最高，可见蔗糖是最适合三七悬浮细胞的碳源。蔗糖添加质量浓度对培养的影响结果如图 4(d)所示，从生物量水平来看，蔗糖质量浓度为 40、50、60g/L 时，这 3 组数据间10020030040050060070001.51043.01044.51046.01047.5104m/zIntensity161.02173.04179.03191.06353.09515.13HOOHOOOOOHOHOHOOOHOHOOHOHOH677.171002003004005000210441046104m/zIntensity135.04161.02173.04179.03191.06353.09515.13HOOHOOOOHOHOHOHOOOHStandardsExtracts of P.notoginseng cells5-CQA(Peak 1)3-CQA(Peak 2)4,5-diCQA glycoside(Peak 3)4,5-diCQA(Peak 4)1015202530Retention time/min300250200150100500Intensity(a)1005015020025030035040001107210731074107m/zIntensity191.06353.09HOOOOHOHOHOHHOO(c)Peak 2(e)Peak 4(d)Peak 35010015020025030035040005.01051.01061.5106m/zIntensity135.04179.03191.06353.09HOOOHOOHOHOOHHO(b)Peak 1图1三 七 愈 伤 组 织 中 CGAs 的 HPLC 与 UPLC-MS/MS 分析Fig.1DetectionofCGAsfromP.notoginsengcalli518华东理工大学学报（自然科学版）第49卷无统计学差异；但 40g/L 蔗糖的添加组 CGAs 产量显著优于 50g/L 和 60g/L 添加组。pH 也对植物细胞生长有影响，通常植物细胞最适 pH 为 5.66.019。但对三七悬浮细胞来说，初始 pH 为 7.5 时，更适合其生长以及促进 CGAs 的生物合成，生物量及 CGAs 产量最终分别达到 15.31g/L 和 155.25mg/L(图 4(e)。综上所述，三七悬浮细胞最佳培养条件：培养基为 B5、40g/L 蔗糖，初始 pH 为 7.5，接种量 15%。此时，生物量及 CGAs 产量分别达到了 15.31g/L 和155.25mg/L。2.2.3优化前后三七愈伤细胞悬浮培养生理状态参数分析三七细胞悬浮培养参数如图 5 所示。由图 5(a)可见，三七悬浮细胞生长呈现典型的“S”型曲线：第 03d 为延滞期，从第 4d 起进入对数生长期，在第 10d 后细胞稳定生长。而 CGAs 属于次级代谢产物，在细胞生长初期，细胞优先生长，CGAs 产量增长缓慢；从第 6d 起，三七悬浮细胞 CGAs 产量开始增加(图 5(b)。培养基体系优化后，第 11d 时，细胞干重及 CGAs 产量达到最大值，分别为 19.40g/L 及667.83mg/L，较优化前分别增加了 24%及 8%。此前有文献报道20，植物细胞不能直接转运蔗糖，需先分解成葡萄糖和果糖再利用。从碳源的变化图(图 5(c)、5(d)中也可看出，三七悬浮细胞生长初期时优先将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，而还原糖浓度呈先增加后下降趋势，这是因为细胞一开始生长缓慢，碳源消耗慢，然后进入对数生长期，快速消耗碳源。初始培养基蔗糖质量浓度为 30g/L，在第6d 已全部分解成葡萄糖和果糖；而优化后培养基蔗糖质量浓度较高，细胞在进入对数生长期时蔗糖没有被全部分解，在细胞生长后期，细胞边分解边利用碳源。氨态氮浓度变化如图 5(e)所示，在细胞生长初期时氨态氮质量浓度快速下降，在第 2d 时，培养基中氨态氮消耗殆尽。电导率变化如图 5(f)所示，在第 58d 时，即对数生长期，细胞快速利用无机离子，细胞进入稳定期后，培养基中无机离子基本被消耗完毕，且培养基优化后的三七悬浮细胞消耗离子速度快于优化前。三七悬浮细胞活性测定结果如图 5(g)所示：优化前后，细胞活性变化趋势基本相近，但从第 3d 起，优化后的三七悬浮细胞活性一直略高于优化前。三七悬浮细胞培养前期活性较低，从第 3d 起活性增加，到第 6d 活性达到最高。结合生物量及培养基营养成分消耗可知，三七悬浮细胞一开始处于延滞期，需要适应培养基环境，活性较低；进入对数生长期，细胞生长分裂活动旺盛，活性开始增加；但从第 6d起，随着培养基营养成分的消耗，活性开始逐渐下降。如图 5(h)所示，三七悬浮细胞有一定的 pH 调节能力，虽然两种培养基的初始 pH 不同，但从第 2dHHHm/z 677HOOHOOOOOHOHOHOOOHOHOOHOHOHHOOHOOOOHOHOHOHOOOHm/z 515HOOHOOHOOHOHOOHm/z 353HHOOHOOHOHOHHOHOOHOHOHHHOOHOHOm/z 179HOHOHm/z 135m/z 191m/z 173GlcQuinicCaffeoylH2OCO2Caffeoyl图2三七愈伤组织中 CGAs 裂解过程Fig.2DeducedfragmentationpathwaysofCGAsfromP.notoginsengcalli(a)P.notoginseng calli(b)P.notoginseng suspension cells图3三七悬浮细胞培养体系的建立Fig.3Development of P.notoginseng suspension cell culturesystem第4期周倍，等：三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性519起，两者无显著差别，总体趋势均先下降至 5.0，然后缓慢提升，最后稳定在 6.07.0。三七细胞生长及 CGAs 产物合成动力学拟合结果如表 1 所示。模型的相关系数（R2）均大于 0.97，说明模型拟合良好；且 0，表明此模型为非生长关联型，即符合次级代谢产物合成特性，因此，可用于描述三七细胞生长及 CGAs 产物合成的生理状态。培养基体系优化后的三七悬浮细胞最大比生长速率(m)为 0.37d1，为优化前 1.73 倍。同时，从CGAs 产物合成曲线也可看出，第 6d 后，培养基体系优化后 CGAs 合成速率明显快于优化前。因此，优化后的培养基体系更适合于三七悬浮细胞的培养。2.3 不同诱导子对三七悬浮细胞生物量及 CGAs 产量影响2.3.1不同诱导子对三七悬浮细胞生物量的影响本实验主要选取了 6 种诱导子：MeJA、YE、SA、ANE、MT、PDE。诱导子通常对细胞的生长有一定的影响21，如图 6(a)6(c)所示，MeJA、YE、SA 在低浓度范围内对三七悬浮细胞生长影响不大，后续随浓度升高，抑制作用越明显。ANE 在本次实验浓度范围内均抑制三七悬浮细胞生长，且不同浓度之间的抑制作用无显著差异(图 6(d)。而 MT 及 PDE 终浓度分别在 10mol/L 和 50mg/L 时反而促进了三七悬浮细胞生物量的积累(图 6(e)、6(f)。0.501.01.52.0020406080100Inoculation size/%Cells biomassproliferation coefficientCGAs yield/(mgL1)Cells biomass proliferation coefficientCGAs yieldedabbccedabbc1/2B5B51/2MSMSN61/2B5B51/2MSMSN602468100255075100125 Basic mediumCells biomass/(gL1)CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)Cells biomassCGAs yieldaacdbabbdcGlucoseSucroseFrutoseArabinoseXyloseGalactoseMannoseMaltoseLactoseMycoseGlucoseSucroseFrutoseArabinoseXyloseGalactoseMannoseMaltoseLactoseMycose0246810020406080100Carbon sourcesCells biomass/(gL1)Cells biomassCGAs yieldbcadebacddbebbceabecfbdfbc051015050100150200(Sucrose)/(gL1)Cells biomass/(gL1)Cells biomass/(gL1)Cells biomassCGAs yieldcdbcabaabceabacd05101520050100150200pHCells biomassCGAs yieldcbbaacbbaab5 10 15 20 25 305 10 15 20 25 30(a)(b)(c)(d)(e)10 20 30 40 50 6010 20 30 40 50 603.0 4.5 6.0 7.5 9.03.0 4.5 6.0 7.5 9.0图4不同培养条件对三七悬浮细胞生物量及 CGAs 产量的影响Fig.4BiomassandCGAsyieldofP.notoginsengsuspensioncellsgrownunderdifferentconditions520华东理工大学学报（自然科学版）第49卷012345678910 11012345678910 11012345678910 11510152025Time/dExperimental data of initial mediumModel prediction data of initial mediumExperimental data of optimized mediumModel prediction data of optimized medium200400600800Time/d012345678910 11Time/d012345678910 11Time/d012345678910 11Time/dTime/d012345678910 11Time/d012345678910 11Time/dCGAs yield/(mgL1)Experimental data of initial mediumExperimental data of optimized mediumModel prediction data of initial mediumModel prediction data of optimized medium10203040(Total sugar)/(gL1)Initial mediumOptimized medium102030(Reducing sugar)/(gL1)Initial mediumOptimized mediumInitial mediumOptimized mediumInitial mediumOptimized mediumInitial mediumOptimized mediumInitial mediumOptimized medium5101520253035(Ammonia nitrogen)/(mgL1)7501 5002 2503 0003 7504 500Conductivity/(Scm1)0.20.40.60.8Cell viability4.55.05.56.06.57.07.5pHCells biomass/(gL1)(a)Kinetics of cells growth(b)Kinetics of CGAs biosynthesis(c)Total sugar(d)Reducing sugar(e)Ammonia nitrogen(f)Conductivity(g)Cell viability(h)pH图5三七细胞悬浮培养参数Fig.5CultureparametersofP.notoginsengsuspensioncells第4期周倍，等：三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性5212.3.2不同诱导子对 CGAs 产量的影响诱导子主要分为非生物诱导子和生物诱导子，已被广泛应用于促进植物细胞生产次级代谢产物21。本实验中，MeJA、SA、YE、MT 属于非生物诱导子，ANE 和 PDE表1三七悬浮细胞生长及 CGAs 产物合成动力学参数Table1KineticsparametersforcellsgrowthandCGAsbiosynthesisofP.notoginsengsuspensioncellsMediumsystemCellgrowthCGAsbiosynthesism/d1R2/(mgL1)/(mgL1d1)R2Initialmedium0.220.010.9839.583.7610.600.480.99Optimizedmedium0.370.010.9736.110.7212.060.180.99misthemaximumspecificgrowthrate;R2isthecorrelationcoefficient0510150200400600800CGAs yield/(mgL1)Cells biomassCGAs yieldababcdcadbced0510150200400600800Cells biomassCGAs yieldaaabcddabbec051015200200400600CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)CGAs yield/(mgL1)Cells biomassCGAs yieldbbabdcaababbccbc051015200200400600Cells biomassCGAs yieldacdebfabcbcbcbc051015200200400600Cells biomassCGAs yieldbacdefbacdee02550125187.525051015200200400600800(PDE)/(mgL1)Cells biomassCGAs yielddaacbcbcabaabcabccCells biomass/(gL1)Cells biomass/(gL1)Cells biomass/(gL1)Cells biomass/(gL1)Cells biomass/(gL1)Cells biomass/(gL1)c(MeJA)/(moLL1)c(SA)/(moLL1)(ANE)/(gL1)0 10 20 30 40 500 10 20 30 40 500 10 25 50 75 1000 10 25 50 75 100(YE)/(gL1)0.100.250.500.751.0000.100.250.500.751.000(a)MeJA(c)SA(e)MT(b)YE(d)ANE(f)PDE005 15 25 40 5005 15 25 40 5050100200300400050100200300400c(MT)/(moLL1)02550125187.52500图6不同诱导子对三七悬浮细胞生物量及 CGAs 产量的影响Fig.6EffectsofdifferentelicitorsoncellsbiomassandCGAsyieldofP.notoginsengsuspensioncells522华东理工大学学报（自然科学版）第49卷属于生物诱导子。各诱导子最佳浓度及最终 CGAs 产量如表 2 所示。结合图 6 可知，除 ANE 外，其余诱导子均对三七悬浮细胞 CGAs 合成有促进作用，其中 MeJA 效果最明显，在终质量浓度为 30mol/L 时，产量可达684.07mg/L，为对照组的 1.44 倍(图 6(a)；其次为PDE 和 YE，在终质量浓度分别为 25mg/L 和 0.1g/L时，产量分别为对照组的 1.31 倍和 1.26 倍(图 6(b)、6(f)；SA 和 MT 最佳质量浓度分别为 100mol/L 和10mol/L，产量都提高至 1.09 倍(图 6(c)、6(d)；ANE反而抑制了三七悬浮细胞生物合成 CGAs(图 6(d)。表2不同诱导子对三七悬浮细胞 CGAs 产量的影响Table2Effects of different elicitors on CGAs yield of P.notoginsengsuspensioncellsElicitorsOptimumcontentCGAsyield/(mgL1)IncreasecoefficientMeJA30mol/L684.071.44YE0.1g/L598.191.26SA100mol/L518.571.09ANE0475.18NoeffectMT10mol/L517.701.09PDE25mg/L622.071.31结果显示，MeJA 为最佳诱导子，且最优诱导浓度为 30mol/L。此前，PDE 鲜少用于诱导合成 CGAs，本研究中 25mg/L 的 PDE 处理后的三七悬浮细胞CGAs 产量提高了 31%，且 PDE 较 MeJA 容易制备、性价比高，是一种有潜力的新诱导子。2.4 三七细胞 CGAs 抗氧化能力分析绿原酸是一种苯丙素类化合物，它具有良好的抗氧化活性，在其化学结构中通常具有共轭体系和特定位置的羟基，可以通过去除自由基中间体并抑制其他氧化反应而终止链式反应22。目前最常用的评价抗氧化剂抗氧化能力的方法为 IC50法，即自由基清除率在 50%时抗氧化剂的浓度。IC50