牵张离子通道通过miRNA-146a_NF-κB通路介导呼吸机相关性肺损伤的实验研究.pdf
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1、基础研究牵张离子通道通过m i R N A a/N F B通路介导呼吸机相关性肺损伤的实验研究福建医科大学附属协和医院心血管外科(福州 )陈梅芳林勇张家欣吕晓钗王阶波基金项目:福建省自然科学基金资助项目(J )福建省心脏医学中心;通信作者;麻醉科【摘要】目的探析呼吸机相关性肺损伤(V I L I)的发生机制,为防治V I L I提供新的理论依据.方法以自主呼吸大鼠为对照组(S组),大潮气量机械通气大鼠为实验组(V组),以牵张离子通道(S A C)阻滞剂大鼠作为干预措施组(VB组),每组各 只;机械通气后比较大鼠肺组织结构和功能、m i R NA a、N F BP 、炎症因子(T N F 、I
2、L )表达有无不同.结果机械通气后大鼠肺组织结构破坏明显,氧合功能明显减低,肺组织m i R NA a表达明显下调,N F BP 表达上调,肺部和全身炎症因子浓度增加.相比V组大鼠,VB组大鼠上述病变程度明显减轻,肺组织m i R NA a表达下调减缓,N F BP 表达上调程度减轻,肺部和全身炎症因子浓度增加幅度减少.结论S A C可能通过m i R NA a/N F B途径介导V I L I发生,有望成为防治V I L I的新靶点.【关键词】牵张离子通道;呼吸机诱导肺损伤;炎症【中图分类号】R ;R 【文献标识码】A【文章编号】()E x p e r i m e n t a l s t u
3、 d yo f s t r e t c h a c t i v a t e dc h a n n e l c o n t r i b u t i n g t o v e n t i l a t o r i n d u c e d l u n g i n j u r y v i am i R N A a/N F Bp a s s w a y CHEN M e i f a n g,L I NY o n g,ZHANGJ i a x i n,L VX i a o c h a i,WANGJ i e b oD e p a r t m e n t o fC a r d i o v a s c u l a
4、 rS u r g e r y,F u j i a nM e d i c a lU n i v e r s i t yU n i o nH o s p i t a l,F u z h o u,F u j i a n ,C h i n a【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T oe x p l o r e t h em e c h a n i s mo f v e n t i l a t o r i n d u c e d l u n g i n j u r y(V I L I)a n d t op r o v i d e s o m ee v i d e n
5、c e sf o r t h ep r o p h y l a x i sa n dt h et r e a t m e n to fV I L I M e t h o d sT h em i c ew e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s:s p o n t a n e o u si n s p i r a t i o n(g r o u pS),h i g ht i d a l v o l u m ev e n t i l a t i o n(g r o u pV),a n dh i g ht i d a lv o l u m ev e
6、 n t i l a t i o nw i t hs t r e t c h a c t i v a t e dc h a n n e l s(S A C)b l o c k e r(g r o u pVB)w i t he a c hg r o u p m i c e L u n gm o r p h o l o g ya n df u n c t i o n,m i R NA ae x p r e s s i o n,N F BP e x p r e s s i o na n d i n f l a mm a t o r yf a c t o r s(TN F ,I L )c o n c
7、e n t r a t i o ni nt h es e r u ma n dl u n gw e r ee v a l u a t e di nt h es e t t i n go fm e c h a n i c a lv e n t i l a t i o n R e s u l t s S e r i o u s l e s i o n i nt h e l u n gw i t ha no b v i o u s l yi m p a i r e do x y g e n a t i o nw e r eo b s e r v e di nt h em i c et h a tr
8、e c e i v e dh i g ht i d a l v o l u m ev e n t i l a t i o n T h ee x p r e s s i o no fm i R NA as i g n i f i c a n t l yr e d u c e d,a n dt h eN F BP i n c r e a s e do nt h ec o n t r a r y S e r u ma n dp u l m o n a r y i n f l a mm a t o r y l e v e l e l e v a t e da f t e r v e n t i l a
9、 t i o n C o m p a r e dw i t hg r o u pV,m o r p h o l o g ya b n o r m i t ya n do x y g e n a t i o nd y s f u n c t i o nr e l i e v e d i n t h em i c e i n t h eg r o u pVB H i g h e rm i R NA a l e v e l,l o w e rN F BP e x p r e s s i o na n d l o w e rl o c a l a n ds y s t e m i c i n f l
10、a mm a t o r y l e v e l sw e r eo b s e r v e d i nt h em i c eo fg r o u pVB C o n c l u s i o n S A Cc o n t r i b u t e s t oV I L I t h r o u g ht h em i R NA a/N F Bp a s s w a ya n d i se x p e c t e dt ob ean o v e l t a r g e t f o r t h ep r o p h y l a x i sa n dt h e t r e a t m e n to f
11、V I L I【K e yw o r d s】s t r e t c h a c t i v a t e dc h a n n e l s;v e n t i l a t o r i n d u c e d l u n g i n j u r y;i n f l a mm a t i o n机械通气导致的肺泡组织的周期性非生理性牵张是造成呼吸机相关性肺损伤(v e n t i l a t o r i n d u c e dl u n gi n j u r y,V I L I)发生的重要机制.近年研究发现,肺组织炎症因子的大量合成、释放和炎性细胞的广泛激活是机械通气后肺泡气血屏障破坏和通透性增加
12、的重要原因.本研究旨在通过大鼠机械通气模型基础上的在体实验,寻找介导V I L I的分子机制,为防治V I L I提供新的靶点.材料与方法 材料:)实验动物:健康成年雄性S p r a g u e D a w l e y(S D)大鼠 只由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供 许可 证 号:S C X K(沪),体 质 量()g.大鼠饲养在恒定温度()控制的环境下,每 h明、暗交替循环,自由饮水和饮食.所有的动物实验均遵照国家实验动物饲养和使用指南.将大鼠随机分为组,以自主呼吸大鼠为对照组(S组),大潮气量机械通气大鼠为实验组(V组),以牵张离子通道(s t r e t c h a c t i
13、v a t e dc h a n n e l s,S A C)阻滞剂大鼠作为干预措施组(VB组),每组各 只,再根据通气时间,各分出h和 h的个亚组.)主 要 材 料 和 仪 器:高 速 离 心 机(H i m a c C R G ,H i t a c h i公司);E L X 酶标仪(B i o t e k牌,Am e r s h a mB i o s c i e n c e公 司);K c j u n i o r(G e n e公 司);超 低 温 冰 箱(T h e r m o 系 列,E l e c t r o n公 司);小 动 物 呼 吸 机(V ,上海玉研科学仪器有限公司);荧光
14、定量扩增仪/P C R仪 S L AN P,企 晟(上 海)医 疗 器 械 有 限 公 司;鼠T N F E L I S A试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司);鼠I L E L I S A试剂盒(上海拜力生物科技有限公司);三氯化钆(S i g m a A l d r i c h公司);抗鼠N F BP 抗体(上海邦景实业有限公司).福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o 方法:大潮气量机械通气模型建立:所有实验大鼠均于术前 m i n肌注阿托品(m g/g),均采用 水合氯醛(m L/g)腹腔内注射麻醉,术中根据麻醉深度追加水
15、合氯醛.尾静脉置管以备术中给药用.静脉套管针穿刺法行气管插管,连接小动物呼吸机(容量控制模式,呼吸频率为 次/m i n,吸呼比,吸入氧浓度 ,潮气量 m L/g).颈总动脉置管,以备抽取动脉血气及留取血清标本.机械通气后若见大鼠胸廓明显起伏,气管穿刺处喷洒生理盐水未见明显气泡溢出,则代表建模成功.干预方法:)S组:气管插管后保留自主呼吸,未给予任何药物,分别于h和 h后各有只大鼠通过放血法处死,并留取肺组织、肺泡灌洗液和血标本.)V组:气管插管后机械通气,未给予任何药物,分别于h和 h后各有只大鼠通过放血法处死,并留取肺组织、肺泡灌洗液和血标本.)VB组:实验前h,经尾静脉注射牵张离子通道(
16、S A C)阻滞剂 M/k g的三氯化钆,即血药浓度为 M,大 鼠 血 容 量 毫 升 数 按 体 质 量(k g)计算,分别于h和 h后各有只大鼠通过放血法处死,并留取肺组织、肺泡灌洗液和血标本.肺损伤情况检测:通过肉眼观察、苏木精伊红染色(HE染色)切片观察肺组织病理改变;通过测定氧合指数(o x y g e n a t i o n i n d e x,O I)、动 脉血 二 氧化 碳分 压(P a C O)评估肺氧合和肺泡通气功能;通过测定肺组织湿/干重值(w e t/d r yr a t i o,W/Dr a t i o)评估肺水肿情况.分子生物学检测:按说明书步骤行E L I S A
17、法检测血清 和 支 气 管 肺 泡 灌 洗 液(b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d,B A L F)中肿瘤坏死因子(T N F )、白介素(I L )浓度;实时定量聚合酶链反应法(q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n,R T q P C R)检测m i R NA a在肺组织的表 达 水 平(m i R NA上 游 引 物 G G G T G A GAA C T G MT T C C A ,下 游 引 物 C
18、 A G T G C G T G T C G T G GA G T ;GA P DH mR NA上 游 引 物 T G GA G T C T A C T G G C G T C T T C ,下 游 引 物 T T C A C A C C C A T C A C AAA C A T G ),检测结果以 C T表示;免疫组织化学法检测肺组织核因子 BP (N F BP )表达水平.统计学分析:采用S P S S 统计软件进行分析.计量资料采用描述性分析法、单因素方差分析(ANOVA)和T u k e y多重比较法;计数资料采用卡方检验法或F i s h e r精确概率法.P 为差异有统计学意义.
19、结果 形态学检测:)肉眼:S组大鼠肺叶大致正常.V组h后大鼠可见肺叶稍肿胀、弹性尚可,肺叶表面偶见出血点,支气管口无液体溢出;h后大鼠病变与h后类似,但程度更重,肺叶弹性较差,支气管口少量淡红色液体渗出.VB组h、h后大鼠上述病理改变有所减轻,损伤程度介于V组和S组之间.)光镜:S组肺泡壁和肺间质毛细血管结构均完整,肺泡腔内均未见明显的细胞和液体渗出,肺间质内仅见少数炎症细胞浸润.V组h后切片可见部分肺泡结构破坏、相互融合,残存的肺泡腔内可见中等量炎性细胞及液体渗出,肺间质稍有肿胀,伴炎症细胞浸润;上述病理改变在 h后可见明显加重.VB组切片中的肺组织病理改变相比V组明显减轻,部分肺泡结构仍完
20、整,仅可见轻中度的肺间质水肿及中等量炎症细胞浸润;VB组大鼠肺组织病变类型类似于V组,但病变程度介于S组和V组之间.见图.图机械通气大鼠肺组织H E染色表现()肺氧合指数与动脉血二氧化碳分压比较:组大鼠机械通气前的O I值、P a C O比较,差异无统计学意义(P ).ANOVA分析显示,机械通气h、h后,组间的O I值 差 异 有 统 计 学 意 义(F ,P );T u k e y多重比较结果显示,机械通气h后,VB组O I值明显高于V组(q ,P ),上述两组O I值在机械通气 h后比较,差异仍有统计学意义(q ,P ).无论是否机械通气,组间的P a C O值比较,差异均无统计学意义(
21、F ,P ).见图、.图机械通气前后O I值改变图机械通气前后P a C O值改变 肺水肿评估:机械通气后,组W/D值比较,差异有统计学意义(F ,P );T u k e y多重比较显示,机械通气h后,VB组和V组W/D值比较,差异无统计学意义(q ,P ),机械通气 h后,福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n ,V o l ,N o VB组 大 鼠W/D值 明 显 低 于V组(q ,P ).见图.图机械通气后W/D改变 肺部和全身炎症反应E L I S A检测:)T N F 水平:血清中,组T N F 浓度比较,差异有统计学意义(F ,P );T u k
22、 e y多重比较,机械通气后h和 h,VB组T N F 浓度均明显低于V组()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ;()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ),图 a.B A L F中,组T N F 浓度比较,差异有统计学意义(F ,P );T u k e y多重比较,机械通气后h和 h,VB组大鼠T N F 浓度均明显低于V组()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ;()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ),图 b.)I L 水平:血清中,组I L 浓度比较,差异有统计学意义(F ,P );T u k e y多重比较,机械通气后h和
23、h,VB组I L 浓度均明显低于V组()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ;()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ),图 c.B A L F中,组I L 浓度比较,差异有统计学意义(F ,P );T u k e y多重比较,机械通气后h和 h,VB组I L 浓度均明显低于V组()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ;()p g/m Lv s()p g/m L,q ,P ),图 d.图机械通气后血清及B A L F中炎症因子浓度改变 肺 组 织R T q P C R检 测:组 机 械 通 气 后 肺 组 织m i R NA a表 达 水 平 比 较,
24、差 异 无 统 计 学 意 义(F ,P ).T u k e y多重比较,机械通气后h,V组和VB组肺组织m i R NA a表达水平比较,差异无统计 学 意 义(v s ,q ,P );机械通气后 h,V组m i R NA a表达水平明显低于VB组(v s ,q ,P ).见图.免疫组织化学染色:N F BP 定位于细胞核,主要表达于肺间质炎症细胞和肺泡内渗出物中.染色强度方面,S组最低,机械通气 h后无明显增强;V组大鼠染色强度最高,且V组与VB组通气h后比较,差异有统计学意福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o 图机械通气后
25、肺组织m i R N A a表达变化义(v s ,q ,P ),V组与VB组通气 h后比较,差异有统计学意义(v s ,q ,P );VB组染色强度介于S组和V组之间.见图.图机械通气后肺组织N F BP 表达改变()讨论V I L I的发生机制主要为气压伤、容积伤、萎陷伤和生物伤,共同造成肺组织弥漫性气血屏障的破坏和通透性增高.围术 期 保 护 性 肺 通 气 策 略 以 低 潮 气 量、个 性 化P E E P、手法肺复张和容许性高碳酸血症为基本特征.在患者围术期治疗全过程中应用该通气策略,有助于预防V I L I.此外,对于目标导向液体输注、心功能维护、践行E R A S理念以及控制感染
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